ГОСТ ISO 13366-1-2014. Межгосударственный стандарт. Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа (контрольный метод)
8.2. Определение
8.2.1 Оптимизация показаний микроскопа
С помощью микроскопа (см. 5.3) в полученном мазке (см. 8.1.1 или 8.1.2) подсчитывают ядра клеток на полях, полностью покрытых мазком молока. Выбирают наилучшее увеличение (500х - 1000х), чтобы получить в среднем не более 20 клеток в каждом поле.
Клетки содержат окрашенные ядра. Размер клеток - не менее 8 мкм. При подсчете не учитывают клетки менее 4 мкм (см. рисунок 1). Фрагменты клеток подсчитывают в окончательном результате, если видно более 50% ядерного материала. Кластеры клеток подсчитывают как одну клетку, если ядра четко не разделены. См. также рисунки 2 и 3.
Макрофаг
8 - 30 мкм
Высокое соотношение цитоплазма/ядро. Фагоцитоз,
представление антигена, секреция хемоаттрактантов
Полиморфонуклеарные лейкоциты
(PMN)
10 - 14 мкм
90% - острый мастит, 60% - хронический мастит. Низкое
соотношение цитоплазма/ядро. Фагоцитоз. Первая линия защиты
от мастита
Лимфоцит
5 - 10 мкм
Низкое соотношение цитоплазма/ядро. Интенсивно окрашенное
ядро T-хелпера, T-супрессора, B-клетки
Эпителиальная клетка
10 - 14 мкм
Ядро круглое. Цитоплазма слабо окрашена
Рисунок 1 - Примеры клеток
Длины клеток L1 = 9,79 мкм и L2 = 2,77 мкм
Рисунок 2 - Примеры клеток сборного коровьего молока
(увеличение 1000х)
Длина клетки: L22 = 9,08 мкм; L23 = 8,27 мкм; L24 = 4,95
мкм; L25 = 7,39 мкм; L26 = 6,37 мкм и L27 = 3,58 мкм
Рисунок 3 - Примеры клеток сборного коровьего молока
В примере кластера, приведенного на рисунке 3, следует подсчитать пять клеток. Клетка L27 пропущена, так как ее диаметр меньше 4 мкм.
Примечание - Высокая квалификация лаборанта является основным условием получения объективных результатов метода. Для ее повышения необходимо частое использование метода и участие в межлабораторных исследованиях.
Клетки в молоке располагаются согласно распределению Пуассона (см. приложение C). Минимальное количество клеток (N), подсчитываемых с учетом требуемого уровня подсчета клеток, с целью достижения указанного коэффициента вариации, приведено в таблице 1.
Таблица 1
Минимальное число клеток N
Концентрация клеток (x 1000 клеток/см3) | Коэффициент вариации CV, % | Число клеток N |
< 150 | 10 | 100 |
150 - 250 | 7 | 200 |
250 - 400 | 6 | 300 |
>= 400 | 5 | 400 |
Достоверность результатов обеспечивается подсчитыванием минимально указанного числа клеток. Поля и полосы, на которых проводят подсчет, выбирают таким образом, чтобы получить представительный подсчет для всего мазка.
8.2.2 Подсчет ядер в последовательных полях микроскопа
Подсчитывают ядра в последовательных полях, в вертикальных полосах в полях, расположенных на равном расстоянии друг от друга (см. рисунок 4 и таблицу 1).
1 - вниз до нижнего края
Рисунок 4 - Вертикальные полосы на полях, расположенных
на равном расстоянии друг от друга, при использовании
круглого или прямоугольного контура
a) Начинают подсчет приблизительно на расстоянии dL от левой стороны. При использовании круглого контура подсчет начинают с соответствующего расстояния dL от левой стороны горизонтального диаметра таким образом, чтобы обеспечить подсчет как минимум 5 полей от верхней части полосы. Для прямоугольного и круглого контура, как правило, используют расстояние dL, равное 0,5 мм.
b) Помещают верхний или нижний край окружности поля тангенциально по отношению к внутренней верхней или нижней границе шаблона (шаблон не должен быть видимым в поле). В случае непокрытой плоскости рядом с границей шаблона регулируют поле в соответствии с границами мазка.
c) После подсчета первого поля объектив микроскопа передвигают на установленное расстояние dH вниз или вверх к следующему полю в направлении нижнего или верхнего края и на новом поле проводят подсчет. Как правило, используют расстояние dH, равное 1 мм.
d) После подсчета на последующем поле повторяют действия, описанные в перечислении c), до достижения противоположной стороны (вверху или внизу) полосы. Далее выбирают один из следующих вариантов:
- вариант 1. Последнее поле не подлежит подсчету;
- вариант 2. При появлении нижней или верхней границы, занимающей меньше половины плоскости поля, смещают объектив до тех пор, пока граница вновь полностью не исчезнет с поля, которое после этого покрывает только мазок, и выполняют подсчет.
e) Затем перемещают объектив вправо на расстояние dW (например, dW = 1,5 мм или dW = 2 мм, в зависимости от необходимого числа полей) и начинают подсчет на новом участке в противоположном направлении (вверх или вниз).
f) Операции b) - e) повторяют до достижения правой стороны шаблона.
g) Если для проведения подсчета полей недостаточно (см. таблицу 1), подсчитывают дополнительные поля. Для выполнения этой операции объектив микроскопа фокусируют на другие зоны (например, посредством изменения исходной позиции и/или адаптации расстояний при поэтапном передвижении) таким образом, чтобы получить надлежащее количество полей, которое является репрезентативным для всего мазка.
h) Проводят подсчет согласно 9.1 при использовании прямоугольного контура или согласно 9.3 при использовании круглого контура.
Примечание - При использовании прямоугольного контура на вертикальных участках размещают 5 полей на расстоянии 1 мм в вертикальных полосах и 10 полос на расстоянии 2 мм, что позволяет производить подсчеты на 50 полях. Приблизительно такое же число полей получают при применении контура круглой формы при использовании тех же расстояний. Расстояния между сдвигами (пространства) измеряются от той же зоны полей с использованием прибора корректировки (выравнивание верхнего или нижнего края) таким образом, чтобы они включали в себя диаметр поля.
8.2.3 Подсчет в прямоугольном контуре по полосам
Подсчитывают ядра в вертикальных полосах, расположенных на равном расстоянии друг от друга (см. рисунок 5 и таблицу 1).
Рисунок 5 - Равноудаленные вертикальные полосы
a) Начинают подсчет с левой стороны приблизительно на расстоянии dL. Как правило, используют расстояние dL, равное 0,5 мм.
b) Начинают подсчет с верхней или нижней границы прямоугольной области. Помещают границу области в середину поля микроскопа. После подсчета всех клеток перемещают объектив в направлении противоположной границы и подсчитывают все клетки, видимые в этой полосе вплоть до достижения противоположной границы. Записывают число подсчитанных клеток.
c) Затем перемещают объектив вправо на расстояние dW (например, dW = 3 - 4 мм, в зависимости от необходимого числа полос для репрезентативного подсчета всего мазка) и начинают подсчет новой полосы.
Операции b) и c) повторяют до достижения правой стороны шаблона.
Если для проведения подсчета полос недостаточно (см. таблицу 1), подсчитывают дополнительные полосы. Для выполнения этой операции объектив микроскопа фокусируют на другие зоны (например, посредством изменения исходной позиции и/или адаптации dW) таким образом, чтобы получить надлежащее количество полос, которое является репрезентативным для всего мазка.
Результат подсчитывают, как описано в 9.2.
Подписаться на обновления