ГОСТ ISO 18416-2013. Межгосударственный стандарт. Продукция парфюмерно-косметическая. Микробиология. Обнаружение Candida albicans
9. Проведение анализа
9.1 Общие положения
Для подготовки пробы, приготовления исходной суспензии и разведений используют стерильные материалы, оборудование и асептические методы. В случае приготовления исходной суспензии в подходящем разбавителе время между окончанием приготовления суспензии и моментом ее внесения в бульон для обогащения не должно превышать 45 мин, если иное не оговорено в соответствующих протоколах или документах.
9.2 Приготовление исходной суспензии в бульоне для обогащения
9.2.1 Общие положения
Пробу из хорошо перемешанной испытуемой продукции в количестве не менее 1 г или 1 см3 вносят в бульон для обогащения объемом не менее 9 см3.
Отмечают навеску S, точную массу или точный объем пробы.
Метод необходимо контролировать для гарантии того, что состав (с добавленным в конце приготовления нейтрализатором) и объем бульона удовлетворяют требованиям (см. 11.3).
Примечание - В некоторых случаях (когда это возможно) фильтруют парфюмерно-косметическую продукцию через мембранный фильтр, который затем погружают в бульон для обогащения, что облегчает нейтрализацию антимикробных свойств продукции (см. 11.3).
9.2.2 Водорастворимая продукция
Навеску S пробы продукции вносят в соответствующий объем бульона.
9.2.3 Нерастворимая в воде продукция
Навеску S пробы продукции вносят в соответствующий объем разбавителя (например, полисорбат 80).
Диспергируют пробу в разбавителе и добавляют соответствующий объем бульона.
9.2.4 Продукция, подвергающаяся фильтрованию
Используют мембранный фильтр с номинальным размером пор не более 0,45 мкм.
Навеску S пробы продукции помещают на мембранный фильтр в фильтровальном аппарате (см. ISO 21148). Сразу же фильтруют и промывают мембранный фильтр, используя определенные объемы воды и/или разбавителя.
Погружают мембранный фильтр в пробирку или колбу подходящего размера, содержащую соответствующий объем бульона.
9.3 Инкубация бульона для обогащения
Инкубируют исходную суспензию, приготовленную в бульоне (см. 9.2), при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение не менее 20 ч, но не более 72 ч.
9.4 Обнаружение и идентификация Candida albicans
9.4.1 Выделение
Стерильной петлей делают пересев аликвоты инкубированного бульона для обогащения на поверхность декстрозного агара Сабуро с хлорамфениколом, чтобы получить изолированные колонии.
Переворачивают чашку Петри и инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение не менее 24 ч, но не более 48 ч. Проверяют наличие характерных колоний (см. таблицу 1).
Таблица 1
Морфологические характеристики Candida albicans
на селективной агаризованной среде
Селективная среда | Характеристика колоний Candida albicans |
Декстрозный агар Сабуро с хлорамфениколом | От белого до бежевого и кремового цветов, выпуклые |
9.4.2 Идентификация
9.4.2.1 Общие положения
Candida albicans могут быть диморфными и способны создавать псевдогифы, некоторые - истинные гифы и грозди круглых бластоконидий, а также крупные толстостенные хламидоспоры. При низкой температуре окружающей среды данная культура может представлять эту псевдомицелиальную форму, однако она может изменяться на одноклеточную форму при повышенных температурах.
Проводят дальнейшее изучение подозрительных колоний, изолированных на декстрозной агаризованной среде Сабуро с хлорамфениколом. Наличие Candida albicans может быть подтверждено и другими подходящими культуральными и биохимическими тестами.
9.4.2.2 Окраска по Граму
Окраску проводят по ISO 21148
Под микроскопом клетки Candida albicans фиолетовые, короткие овальные или удлиненные, иногда почкуются.
9.4.2.3 Образование "ростковой трубки"
Помещают 0,5 - 1 см3 сыворотки (фетальная телячья или лошадиная сыворотка) в небольшую пробирку.
Эмульгируют небольшую часть колонии дрожжей в сыворотке.
Инкубируют на водяной бане при температуре (37 +/- 1) °C в течение 1,5 - 2 ч или в термостате при температуре (37 +/- 2) °C в течение 3 ч.
Помещают каплю сыворотки на предметное стекло, закрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом образование "ростковой трубки".
"Ростковые трубки" появляются в виде цилиндрических волокон (нитей) из бластопор без каких-либо сужений (перетяжек) в месте возникновения и без утолщений вдоль длины волокна.
Образование "ростковых трубок" является признаком присутствия Candida albicans.
Если "ростковые трубки" не были сформированы, колонии исследуют на образование псевдогифов и хламидоспор согласно 9.4.2.4.
9.4.2.4 Культура на кукурузном агаре с 1%-ным полисорбатом 80
Петлей делают посев небольшой части дрожжевой колонии на поверхности среды через центр чашки Петри. На штрих помещают стерильное покровное стекло.
Инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C до 3 дней.
Через 24 ч снимают крышку чашки Петри и изучают полученный рост через стекло под микроскопом с увеличением от 100х до 400х.
Candida albicans образует крупную, сильно преломляющую, толстостенную хламидоспору, которая может быть расположена терминально или на коротких боковых ветвях.
Подписаться на обновления