ГОСТ 33463.6-2016. Межгосударственный стандарт. Системы жизнеобеспечения на железнодорожном подвижном составе. Часть 6. Методы гигиенической оценки системы водоснабжения

Приложение Д

(обязательное)

 

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, РАСТВОРОВ, РЕАКТИВОВ

 

Д.1 Общие положения

Сухие питательные среды хранят в сухих проветриваемых помещениях, в темноте, при комнатной температуре. Открытые упаковки тщательно закупоривают. Среды с измененным внешним видом (уплотненные, с комками), а также с истекшим сроком годности не используют.

Для приготовления растворов, реактивов и питательных сред применяют воду дистиллированную по ГОСТ 6709.

Питательные среды готовят в посуде из инертного материала.

Учитывая возможное изменение pH питательных сред после кипячения и стерилизации, окончательный контроль pH проводят из контрольного флакона с готовой средой при температуре 25 °C с использованием индикаторных полосок или потенциометрическим методом с применением стеклянного электрода.

После стерилизации питательные среды оставляют для охлаждения при комнатной температуре. При необходимости розлива в чашки Петри среды охлаждают до температуры (50 - 60) °C.

Температура сред, хранящихся в холодильнике, перед посевом должна быть доведена до комнатной.

Д.2 Питательный бульон

Д.2.1 Питательный бульон готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.

Д.2.2 Питательный бульон (десятикратный) для колифагов готовят путем увеличения в 10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке.

Д.3 Питательный агар

Д.3.1 Питательный агар готовят из сухого препарата промышленного производства по способу, указанному на этикетке.

Д.3.2 Питательный агар для определения колифагов прямым методом готовят, увеличивая навеску сухого препарата в 2 раза от рецептуры приготовления (см. Д3 приложения Д).

Д.3.3 Питательный агар запрещается выдерживать в расплавленном состоянии более 8 ч. Оставшийся неиспользованным агар повторному расплавлению не подлежит.

Д.3.4 Полужидкий питательный агар готовят следующим образом: сухой питательный бульон (15 г) и агар микробиологический (3 г) растворить при нагревании в 1000 см³ дистиллированной воды. Довести pH до 7,0 - 7,2, разлить в пробирки и стерилизовать автоклавированием при 121 °C в течение 15 мин.

Д.3.5 Питательный агар со стрептомицином готовят из расчета содержания 100 мкг стрептомицина на 1 см³ питательного агара, приготовленного по стандартной рецептуре. В стерильных условиях на стерильной дистиллированной воде готовят раствор стрептомицина в концентрации 10 мг на 1 см³. В готовый питательный агар, отмеренный по объему и остуженный до температуры (47 +/- 2) °C, вносят приготовленный стерильный раствор стрептомицина из расчета 0,1 см³ на 10 см³ питательного агара. Разливают в пробирки для приготовления скошенного агара.

Повторное расплавление питательной среды со стрептомицином запрещается.

Д.4 Фуксин-сульфитная среда Эндо

Д.4.1 Основная модификация

Готовят из сухого препарата по способу, указанному на этикетке. Если на поверхности среды заметны следы влаги, чашки перед посевом необходимо подсушить в термостате. Срок хранения чашек со средой - не более 2 - 3 сут в темноте, если производителем не оговорены другие сроки.

Д.4.2 Повышение дифференцирующих свойств среды

Для повышения дифференцирующих свойств среды в готовую и охлажденную до (60 - 70) °C среду перед разливкой в чашки допускается прибавлять на 100 см³ среды 0,2 см³ 5%-ного спиртового раствора основного фуксина. Срок хранения раствора фуксина - не более 1 мес.

Д.4.3 Модификация среды с добавлением розоловой кислоты

В случаях, когда мембранные фильтры зарастают посторонней микрофлорой, не относящейся к бактериям кишечной группы, помимо фуксина, допускается добавление на 100 см³ среды Эндо 0,2 см³ 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты. Срок хранения раствора розоловой кислоты - не более 1 мес.

Модификацию среды Эндо с добавлением розоловой кислоты используют только при работе методом мембранной фильтрации.

Д.5 Приготовление хромокультколиформ агара для ускоренного одновременного определения E. coli и колиформных бактерий в одном посеве

Агар готовят из сухого препарата, разрешенного к применению по 8.1.6, по способу, указанному производителем.

Нагревают навеску агара на кипящей водяной бане, периодически помешивая, до полного растворения частиц в течение 35 мин. Не допускается автоклавировать и перегревать.

Готовую среду охлаждают до температуры (45 - 50) °C и разливают в чашки Петри.

Срок хранения питательной среды при температуре от 2 °C до 8 °C в защищенном от света месте - не более 21 сут.

Для предотвращения от высыхания чашки со средой рекомендуется поместить в пластиковые мешки.

Готовая среда должна иметь желтоватый цвет.

Д.6 Лактозо-пептонная среда

10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения ингредиентов устанавливают pH 7,4 - 7,6, разливают по 10 см³ в пробирки, стерилизуют при (112 +/- 2) °C 12 мин.

Для приготовления концентрированной лактозо-пептонной среды все ингредиенты, кроме воды, увеличивают в 10 раз, разливают по 1 см³ в пробирки и по 10 см³ во флаконы.

Д.7 Питательные среды для подтверждения способности ферментировать лактозу до кислоты и газа

Д.7.1 Полужидкая среда с лактозой из сухого препарата

Готовят по способу, указанному на этикетке.

Срок хранения - не более двух недель при комнатной температуре.

Посев производят уколом до дна пробирки. При образовании кислоты цвет питательной среды изменяется в соответствии с использованным индикатором. При газообразовании газ скапливается по уколу или на поверхности, или в толще среды появляются разрывы. При инкубации посевов более 5 ч газ может улетучиться. В таких случаях на присутствие газа указывают оставшиеся в толще среды "карманы" - потемнения среды на месте бывшего пузырька газа.

Д.7.2 Полужидкая среда с лактозой

Готовят при отсутствии сухого препарата.

В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, (4 - 5) г агар-агара, доводят до кипения, устанавливают pH 7,2 - 7,4, добавляют 1 см³ 1,6%-ного спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы, нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки на высоту от 3 до 5 см и стерилизуют при (112 +/- 2) °C 12 мин. Срок хранения - не более двух недель при комнатной температуре.

Готовая среда имеет зеленый цвет с синеватым оттенком. При образовании кислоты цвет среды изменяется на желтый.

Д.8 Реактивы для оксидазного теста

Д.8.1 Вариант 1

1%-ный водный раствор тетраметил-п-фенилендиамина гидрохлорид. Готовят непосредственно перед использованием.

Д.8.2 Вариант 2

Реактив N 1: 1%-ный спиртовой раствор .

Реактив N 2: 1%-ный водный раствор фенилендиаминового соединения.

Растворы сохраняют в темных флаконах с притертыми пробками:

1 - до одного месяца, 2 - до одной недели. Перед употреблением к трем частям первого раствора добавляют семь частей второго раствора.

Могут быть использованы коммерческие тест-системы для постановки оксидазного теста.

Перед работой с каждой серией проб реактивы или тест-системы на оксидазу следует испытывать на эталонных тест-микроорганизмах, дающих положительную (P. aeruginosa или P. fluorescens) и отрицательную оксидазную реакцию (E. coli).

Д.9 Приготовление энтерококкагара

Д.9.1 Энтерококкагар готовят из сухого препарата по способу, указанному производителем.

При приготовлении следует обратить внимание на следующие приемы, необходимые для предохранения от разрушения ТТХ при нагревании:

- навеску питательной среды следует предварительно замочить на время от 0,5 до 1 ч в небольшом объеме дистиллированной воды;

- раствор питательной среды довести до кипения и кипятить при постоянном помешивании в течение не более 1 мин до полного расплавления агара, строго соблюдая время кипячения;

- раствор расплавленного агара быстро охладить до температуры от 45 °C до 50 °C следующим способом: емкость, в которой готовили энтерококкагар, поместить в сосуд с водой температурой от 45 °C до 50 °C, постоянно перемешивая питательную среду до охлаждения; затем разлить в чашки Петри до застывания. Готовую питательную дифференциальную среду в чашках Петри хранить в защищенном от света месте при температуре (5 +/- 3) °C не более двух недель.

Д.9.2 Приготовление азидной среды Сланеца-Бертли (модификация)

Сухой питательный агар в количестве, указанном производителем, и 4 г калия фосфорнокислого однозамещенного расплавляют при нагревании в 1000 см³ дистиллированной воды. Разливают в термостойкие емкости и стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C в течение 20 мин.

Перед применением в расплавленную и слегка остуженную основу среды из расчета на 100 см³ добавляют 2 см³ дрожжевого экстракта, 1 г глюкозы, 0,04 г азида натрия и 1 см³ 1%-ного водного раствора 2,-3,-5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ). Тщательно перемешивают, устанавливают pH раствора 7,1 и разливают в чашки Петри слоем толщиной 0,5 см. Готовую среду в чашках Петри хранить в защищенном от света месте при температуре (5 +/- 3) °C не более двух недель.

Примечание - Азид натрия - высокотоксичное и мутагенное вещество. При работе с ним должны применяться средства защиты органов дыхания. Азидсодержащие среды не должны смешиваться с сильными кислотами во избежание образования токсичных компонентов. Растворы, содержащие азид натрия, могут образовывать взрывоопасные компоненты при контакте с металлическими трубопроводами.

 

Д.9.3 Приготовление солевого агара с ТТХ для подтверждения наличия энтерококков

Сухой питательный агар в количестве, указанном производителем, и 65 г хлорида натрия растворяют при нагревании в 1000 см³ дистиллированной воды, после чего разливают мерно в термостойкие емкости и стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C в течение 20 мин.

Перед применением в расплавленную основу среды из расчета на 100 см³ добавляют 1 г глюкозы, 2 см³ дрожжевого экстракта или другого дрожжевого препарата, 1 см³ водного 1%-ного раствора ТТХ. Тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Готовую среду в чашках Петри хранят в защищенном от света месте при (5 +/- 3) °C не более двух недель.

Д.9.4 Приготовление желчь-эскулин-азидного агара

Компоненты среды приведены в таблице Д.1.

 

Таблица Д.1

 

Компоненты среды	Масса (объем)
Триптон, г	17,0
Пептон, г	3,0
Дрожжевой экстракт, см3	5,0
Дегидратированная желчь, г	10,0
Хлорид натрия, г	5,0
Цитрат аммония-железа (III), г	0,5
Эскулин, г	1,0
Азид натрия, г	0,15
Агар (в зависимости от инструкций производителя), г	От 8 до 18
Вода дистиллированная, см3	Доводится до 1000

 

Составляющие растворяют в воде при кипячении и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин. pH раствора после стерилизации (при температуре 25 °C) - (7,1 +/- 0,1). Среду охлаждают, медленно выливают в стерильные чашки Петри слоем 3 - 5 мм и оставляют для остывания на горизонтальной поверхности.

Срок хранения готовой среды в темноте - не более двух недель при температуре (5 +/- 3) °C.

Д.9.5 Приготовление растворов для разведений

Д.9.5.1 Приготовление солевого (физиологического) раствора

8,5 г хлорида натрия растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды. Устанавливают pH раствора, равное (7,0 +/- 0,1). Раствор разливают в термостойкие емкости и стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C в течение 15 мин. После стерилизации при необходимости корректируют pH раствора: значение pH раствора должно быть (7,0 +/- 0,1).

Срок хранения раствора при температуре (23 +/- 2) °C - не более 1 мес.

Д.9.5.2 Приготовление пептонного раствора

1 г пептона растворяют при кипячении в 1000 см³ дистиллированной воды. Устанавливают pH раствора. Значение pH должно быть равно (7,0 +/- 0,1). Раствор стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C в течение 20 мин. После стерилизации при необходимости корректируют pH раствора: значение pH раствора должно быть (7,0 +/- 0,1).

Срок хранения раствора при температуре (23 +/- 2) °C - не более 1 мес.

Д.9.5.3 Приготовление пептонно-солевого раствора

8,5 г хлорида натрия и 1 г пептона растворяют при кипячении в 1000 см³ дистиллированной воды. Устанавливают pH раствора. Значение pH должно быть равно (7,0 +/- 0,1). Стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C в течение 20 мин. После стерилизации при необходимости корректируют pH раствора: значение pH раствора должно быть (7,0 +/- 0,1).

Срок хранения раствора при температуре (23 +/- 2) °C - не более 1 мес.

Д.10 Минеральная среда Бонде

Компоненты среды приведены в таблице Д.2.

 

Таблица Д.2

 

Компоненты	Масса (объем)
Натрий лимоннокислый трехзамещенный, г	28
Натрий аммоний фосфорнокислый, г	15
Калий фосфорнокислый однозамещенный, г	10
Магний сернокислый (сульфат магния), г	2
Вода дистиллированная, см3	1000

 

Ингредиенты растворяют при нагревании, стерилизуют при 1 атм. 20 мин. Перед посевом добавляют 5 см³ 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового на 100 см³ среды.

Д.11 Среда Блеск

100 см³ питательного агара, стерильного, приготовленного из сухого препарата по рецептуре на этикетке, расплавляют на водяной бане. После охлаждения до температуры (45 - 50) °C добавляют 0,3 г L-аргинина, 8 см³ 10%-ного водного раствора трифенилтетразолий хлорида (ТТХ), 10 см³ стерильного обезжиренного теплого молока, тщательно перемешивают и разливают в чашки слоем не менее 25 см³.

Д.12 Магниевая среда накопления в экспедиционной модификации

Предварительно готовят навески всех ингредиентов среды в расфасованном виде, которые затем вносят в исследуемую воду в соответствии с рецептурой, указанной в таблице Д.3:

 

Таблица Д.3

 

Компоненты среды	Масса (объем) компонентов
	при объеме исследуемой пробы воды:
	500 см3	100 см3
Магний хлористый кристаллический, г	19,5	3,9
Натрий хлористый, г	4,0	0,8
Калий фосфорно-кислый однозамещенный безводный, г	0,8	0,16
10%-ный раствор пептона, см3	25,0	5,0
Дрожжевой экстракт, см3	11,0	2,5
Бриллиантовый зеленый 0,1%-ный водный раствор, см3	2,5	0,5

 

Каждую навеску ингредиента вносят в исследуемый объем воды по одному, сразу после полного растворения предыдущего. Далее добавляют 10%-ный раствор пептона, дрожжевой экстракт и 0,1%-ный раствор бриллиантового зеленого в соответствии с рецептурой.

Допускается использование стерильных емкостей, в которые в условиях стационарной лаборатории внесены сухие ингредиенты. Срок хранения не более 7 сут.

Д.13 Приготовление дрожжевого экстракта

1000 г прессованных (пекарских) дрожжей распределяют равномерно в 2000 см³ дистиллированной воды, прогревают в автоклаве при 100 °C 30 мин, отстаивают в холодильнике от 4 до 5 сут. Надосадочную жидкость разливают во флаконы объемом 50 и 100 см³, прибавляют на каждые 100 см³ экстракта 1,25 см³ 0,01%-го водного раствора кристаллического фиолетового, вновь прогревают при 100 °C 30 мин. Хранят экстракт в холодильнике.

Применяют также сухой дрожжевой экстракт промышленного производства (в соответствии с инструкцией производителя).

Д.14 Висмут-сульфит агар

Готовят из сухого препарата промышленного производства по указанию на этикетке.

Д.15 Селенитовый бульон для выделения патогенных энтеробактерий

Готовят из сухого препарата промышленного согласно инструкции, указанной производителем на этикетке, с соблюдением срока реализации среды.

Для приготовления селенитового бульона двойной концентрации увеличивают навеску сухого препарата в два раза на тот же объем дистиллированной воды.

Д.16 Приготовление разбавлений

Для посева объемов воды, меньших чем 1 см³, используют разбавления анализируемой воды. Перед посевом растворы для разбавления разливают по 9 см³ в пробирки с соблюдением правил стерильности. Затем в первую пробирку с 9 см³ раствора вносят 1 см³ анализируемой воды. При этом пипетка не должна быть опущена ниже поверхности воды, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. Другой стерильной пипеткой продуванием воздуха тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают из нее 1 см³ и переносят в чашку Петри, что будет соответствовать посеву 0,1 см³ анализируемой воды. При необходимости посева меньших объемов этой же пипеткой переносят 1 см³ содержимого первой пробирки в следующую пробирку с 9 см³ раствора для разбавления. Другой стерильной пипеткой делают посев 1 см³ из второй пробирки, что будет соответствовать посеву 0,01 см³ анализируемой воды. В случаях высокого уровня загрязнения воды разбавление продолжают аналогично, каждый раз меняя пипетку.

Время от момента приготовления разбавлений и их использования не должно превышать 30 мин.