ГОСТ 33463.6-2016. Межгосударственный стандарт. Системы жизнеобеспечения на железнодорожном подвижном составе. Часть 6. Методы гигиенической оценки системы водоснабжения

8.6. Определение P. aeruginosa

8.6.1 Метод 1

При обнаружении на мембранном фильтре, помещенном на среду Эндо, при посеве пробы воды на колиформные бактерии и (или) E. coli роста изолированных оксидазоположительных бактерий проводят определение показателя P. aeruginosa и устанавливают "наличие-отсутствие" этих бактерий в исследованной пробе воды.

Для подтверждения показателя P. aeruginosa снимают с фильтра 2 - 3 изолированные колонии и производят посев на чашку Петри со средой "Блеск" путем укола, затем культуру растирают вокруг укола в виде бляшки диаметром от 2,0 до 2,5 см. После чего посевы инкубируют в термостате при температуре (36 +/- 2) °C в течение (24 +/- 2) ч.

В случае сливного или сплошного роста оксидазоположительных бактерий проводят рассев на чашки Петри с питательным агаром с целью получения чистой культуры, посевы инкубируют в термостате при температуре (36 +/- 2) °C в течение (24 +/- 2) ч. После чего повторяют процедуру посева на среду "Блеск".

При наличии роста на среде "Блеск" темно-малиновых колоний с золотыми вкраплениями, имеющих специфический сладковатый цветочный запах, и подтверждении наличия диффундирующего пигмента на скошенном питательном агаре отмечают наличие P. aeruginosa в исследуемой пробе воды.

8.6.2 Метод 2

Обнаружение P. aeruginosa в пробе воды состоит из трех этапов:

- накопление в жидкой среде обогащения;

- выделение P. aeruginosa на плотной селективно-дифференциальной среде;

- идентификация P. aeruginosa с использованием ограниченного набора наиболее надежных тестов.

Исследуют пробу воды объемом 1000 см³. В качестве среды накопления используют минеральную среду Бонде с кристаллическим фиолетовым.

В две стерильные емкости мерно наливают по 50 см³ концентрата среды Бонде и по 2,5 см³ 0,01%-ного водного раствора кристаллического фиолетового, после чего в каждую емкость наливают по 500 см³ пробы воды.

Инкубацию посевов осуществляют при температуре (36 +/- 2) °C в течение промежутка времени от 24 до 48 ч. Через 24 ч посевы просматривают. При отсутствии пленки и помутнения среды посевы инкубируют до 48 ч. Отсутствие роста в среде накопления через 48 ч позволяет выдать отрицательный ответ.

При помутнении среды "Бонде" и образовании на поверхности тонкой прозрачной пленки, поднимающейся по стенке емкости, проводят пересев из среды обогащения на сектора плотной среды "Блеск" или цетримидный агар или азидной среды. Емкость перед посевом не встряхивают. Бактериологической петлей забирают пленку с поверхности среды и производят посев уколом ближе к краю чашки Петри для снятия излишков посевного материала, потом остаток материала распределяют в виде бляшки диаметром от 2,0 до 2,5 см, далее посев проводят частыми многочисленными штрихами по поверхности среды для получения максимального количества изолированных колоний. Посевы помещают в термостат при (36 +/- 2) °C на время от 24 до 48 ч с предварительным просмотром через 24 ч инкубации.

На цетримидном агаре колонии P. aeruginosa образуют желтовато-зеленый пигмент (пиоцианин), флуоресцирующий в ультрафиолетовом свете (УФ-свете). При нечетком результате проводят идентификацию по дополнительным тестам.

На среде "Блеск" колонии P. aeruginosa сплошь покрыты золотистым налетом либо содержат многочисленные золотистые вкрапления. Иногда вокруг колонии отмечается просветление или светло-красное окрашивание среды. Часто колонии P. aeruginosa принимают веретенообразную форму, как бы распространяясь по вдавлению в агаре от штриха петлей. Появление блеска можно наблюдать уже через (21 +/- 1) ч инкубации при температуре (36 +/- 2) °C, но максимальное проявление блеска достигается через (43 +/- 1) ч. Среда "Блеск" является ингибиторной для всех грамположительных и большинства грамотрицательных бактерий и лишь немногие ТТХ-резистентные энтеробактерии могут развиваться на среде "Блеск" в виде темно-красных разного размера колоний, лишенных блеска, или выпуклых блестящих ярко-красных колоний.

При наличии множественного роста колоний с золотистым блеском достаточно отобрать для последующего исследования 1 - 2 изолированные наиболее типичные колонии. При росте единичных колоний с блеском или с золотистыми вкраплениями следует отбирать все типичные колонии, но не более 5 - 6.

Примечание - В соответствии со стандартами ИСО допускается определение P. aeruginosa методом мембранной фильтрации с помещением фильтров с посевами на цетримидный агар.

 

8.6.3 Подтверждение обнаружения P. aeruginosa

Для подтверждения обнаружения P. aeruginosa наиболее типичные колонии отсевают на питательный агар и идентифицируют на тест-системе "неферм-тест".

По методу 2 P. aeruginosa не должны содержаться в 1000 см³ исследуемой воды.