ГОСТ 33463.6-2016. Межгосударственный стандарт. Системы жизнеобеспечения на железнодорожном подвижном составе. Часть 6. Методы гигиенической оценки системы водоснабжения

8.5. Определение колифагов прямым методом

8.5.1 Общие положения

Показатель "Колифаги" предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды в отношении возможного вирусного загрязнения.

Метод основан на предварительном накоплении колифагов в среде обогащения на культуре E. coli и последующем выявлении зон лизиса (просветления) посева газоном E. coli на питательном агаре.

8.5.2 Подготовка тест - культуры E. coli K12F⁺ Str-r

На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь, приготовленную следующим образом: культуру E. coli K12F⁺ Str-r засевают в пробирку на скошенный питательный агар. Через (18 +/- 2) ч инкубации при температуре (36 +/- 2) °C производят смыв бактерий с косяка 5 см³ стерильного физиологического раствора и по стандарту мутности готовят взвесь E. coli в концентрации 10⁹ бактериальных клеток в 1 см³.

Примечание - Допускается использование 4-часовой бульонной культуры E. coli K₁₂F⁺ Str-r, полученной при температуре инкубации (36 +/- 2) °C, для внесения в питательный агар, расплавленный и остуженный до (44,0 +/- 0,5) °C. Концентрация 10⁹ бактериальных клеток E. coli содержится в 2 см³ питательного бульона.

 

8.5.3 Выполнение анализа

В исследуемую пробу воды объемом 100 см³ вносят 10 см³ 10-кратного питательного бульона и 1 см³ подготовленного смыва тест-культуры или 2 см³ 4-часовой бульонной культуры.

Для контроля культуры 0,1 см³ смыва бактерий E. coli (или 0,2 см³ 4-часовой бульонной культуры) помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром.

Исследуемую пробу воды (100 см³) и чашку Петри с контролем E. coli помещают в термостат при температуре (36 +/- 2) °C на (18 +/- 2) ч.

В зависимости от плотности используемого агара проводят посевы воды по 10 см³ на 10 чашек или по 20 см³ на 5 чашек. Для освобождения исследуемой воды от сопутствующей бактериальной флоры, ее обрабатывают хлороформом из расчета 1 см³ хлороформа на 10 см³ воды. Пробу тщательно встряхивают и отстаивают в течение 15 мин при комнатной температуре для осаждения хлороформа. На исследование берут воду над хлороформом. В питательный агар, расплавленный и остуженный до (44,0 +/- 0,5) °C, добавляют смыв E. coli K₁₂F⁺ Str-r (см. 8.5.2) из расчета 1,0 см³ смыва на каждые 100 см³ агара, после чего перемешивают. Для контроля культуры E. coli на возможную контаминацию ее посторонними колифагами в одну чашку Петри вносят 10 см³ стерильной водопроводной воды, прогретой до температуры от 20 °C до 25 °C, заливают 25 см³ приготовленного агара с E. coli K₁₂F⁺ Str-r и осторожно перемешивают.

Исследуемые объемы воды вносят в стерильные чашки Петри и заливают, слегка приоткрывая крышки, 25 см³ смеси агара с кишечной палочкой. При посеве пробы воды объемом 100 см³ ее предварительно нагревают до температуры (20 - 25) °C.

Содержимое чашек осторожно перемешивают и оставляют при комнатной температуре до застывания. Чашки с застывшим агаром помещают в термостат дном вверх и инкубируют при температуре (36 +/- 2) °C в течение (18 +/- 2) ч.

8.5.4 Учет результатов

Просмотр посевов осуществляется в проходящем свете.

При исследовании 100 см³ воды (5 чашек по 20 см³) подсчитывают и суммируют все бляшки, выросшие на чашках Петри.

Если посевная доза была меньше 100 см³, то число колифагов вычисляют по формуле

 

, (3)

 

где a - сумма бляшек на чашках;

V - объем исследуемой воды.

При исследовании децинормальных разведений, число колифагов в 100 см³ воды вычисляют по формуле

 

(4)

 

где a - сумма бляшек на чашке;

p_i - i-е разведение;

n - количество p_i разведений.

Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 см³ пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.

Предварительный учет результатов можно проводить через промежуток времени от 5 до 6 ч инкубации. На этом этапе при наличии четких зон лизиса может быть выдан предварительный ответ о присутствии колифагов в воде.

Окончательный количественный учет прямого посева проводится через (18 +/- 2) ч. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 см³ пробы воды.

Если отмечен сливной рост бляшек и счет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: "Обнаружено в 100 см³ воды".

При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.

8.5.5 Постановка контролей

"Отрицательный контроль" - подтверждает отсутствие контаминации фагом питательных сред, лабораторной посуды, оборудования на этапах подготовки и проведения анализа, а также позволяет оценить способность тест-культуры E. coli давать равномерный газон.

"Отрицательным контролем" служит исследование стерильной водопроводной воды, проводимое аналогично анализируемой пробе воды. С этой целью, в зависимости от посевной дозы исследуемой воды, в стерильную чашку Петри вносят от 1 до 20 см³ стерильной водопроводной воды, заливают смесью мясо-пептонного агара с E. coli и инкубируют в течение 18 - 20 ч при температуре (36 +/- 2) °C.

В случае обнаружения бляшек колифагов в чашках с "отрицательным" контролем результаты исследования всей серии проб воды недействительны.

Следует проверить стерильность лабораторного оборудования, посуды, питательных сред, а также повторить контрольный посев на лизогенность тест-штамма E. coli K₁₂F⁺ Str-r.

Для проверки культуры на лизогенность необходимо использовать новую пробирку с культурой, хранящейся на полужидком агаре. 1 см³ бактериальной взвеси помещают в стерильную чашку Петри и заливают расплавленным и остуженным до температуры в диапазоне от 45 °C до 49 °C питательным агаром, инкубируют при температуре (36 +/- 2) °C в течение (18 +/- 2) ч.

Просмотр посевов осуществляют в проходящем свете. Наличие зон лизиса в контрольном посеве свидетельствует о спонтанно проявившемся свойстве культуры продуцировать фаги или контаминации ее колифагом в процессе работы.

Использование в работе лизогенной культуры запрещается. Необходимо получить новую лиофилизированную культуру.

8.5.6 Методика подтверждения фаговой природы лизиса

С целью подтверждения фаговой природы лизиса бактериологической петлей извлекают участок агара с бляшкой колифага, вызывающей сомнение, помещают его в 5 см³ питательного бульона, куда добавляют каплю тест-культуры E. coli K₁₂F⁺ Str-r и инкубируют при (36 +/- 2) °C в течение (18 +/- 2) ч. Полученную культуру обрабатывают хлороформом или фильтруют через мембранный фильтр и исследуют на наличие фага. Высев осуществляют петлей или пипеткой на поверхность питательного агара содержащего взвесь E. coli, чашки инкубируют в термостате при (36 +/- 2) °C в течение (18 +/- 2) ч. Наличие зон лизиса на поверхности агара расценивается как подтверждение наличия фага.