ГОСТ 33635-2015. Межгосударственный стандарт. Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Испытание токсичности на хирономидах с использованием обогащенного осадка

Приложение А

(рекомендуемое)

 

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО КУЛЬТИВИРОВАНИЮ CHIRONOMUS RIPARIUS

 

1 Личинки Chironomus культивируют в кристаллизационных чашках или более крупных контейнерах. Мелкий кварцевый песок распределяют слоем высотой примерно 5 - 10 см над дном контейнера. Было показано, что кизельгур (например, Merck, Art 8117) является подходящим субстратом (достаточным является более тонкий слой в несколько мм). Затем добавляют соответствующую требованиям воду на высоту несколько см. Уровень воды пополняют при необходимости для восстановления потерь в результате испарения и предупреждения высыхания. Воду заменяют при необходимости. Проводят легкую аэрацию. Сосуды с культивируемыми личинками находятся в подходящей камере, которая будет предупреждать вылет вылупившихся взрослых особей. Камера должна быть достаточно большой, чтобы обеспечить роение вылупившихся взрослых особей, иначе не будет происходить копуляция (минимальный размер составляет примерно 30 x 30 x 30 см).

2 Камеры находятся при комнатной температуре или при постоянной температуре окружающей среды (20 +/- 2) °C со световым периодом 16 ч свет (интенсивность примерно 1000 лк), 8 ч - темнота. Имеются данные, что влажность воздуха менее 60% относительной влажности может тормозить репродукцию.

Вода для разведения

3 Используют любую соответствующую требованиям природную или искусственную воду. Обычно используют колодезную воду, дехлорированную водопроводную воду и искусственные среды (например, среда Elendt "M4" или "M7", см. ниже). Перед применением воду аэрируют. При необходимости культуральную воду обновляют, осторожно сливая или откачивая использованную воду из сосудов для культивирования, не нарушая трубочек личинок.

Кормление личинок

4 Личинок Chironomus кормят хлопьевидным кормом для рыб (, или кормом для рыб другой аналогичной марки) из расчета примерно 250 мг на сосуд в сутки. Корм вносят в виде сухого размельченного порошка или в виде суспензии в воде: 1,0 г хлопьевидного корма добавляют к 20 мл воды для разведения и перемешивают для получения однородной смеси. Такую суспензию скармливают из расчета 5 мл на сосуд в сутки (перед использованием встряхивают). Личинки более старшего возраста получают большее количество корма.

5 Кормление корректируют в зависимости от качества воды. Если культуральная среда становится "мутной", то количество вносимого корма уменьшают. Добавление корма тщательно контролируют. Слишком малое количество корма будет вызывать переселение личинок по водной колонке, а слишком большое количество корма будет вызывать повышенную микробиологическую активность и снижение концентрации кислорода. Оба фактора могут приводить к пониженным скоростям роста.

6 При закладке новых сосудов для культивирования также можно добавлять некоторые зеленые водоросли (например, Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).

Кормление вылупившихся взрослых особей

7 Некоторые экспериментаторы предложили использовать ватные палочки, пропитанные насыщенным раствором сахарозы, служащие в качестве корма для вылупившихся взрослых особей.

Вылупление

8 При температуре (20 +/- 2) °C взрослые особи начинают вылупляться в сосудах с культивируемыми личинками примерно через 13 - 15 сут. Самцов легко отличить по перистым усикам.

Кладки яиц

9 После появления взрослых особей внутри камеры для культивирования все сосуды для культивирования личинок тщательно осматривают три раза в неделю на отложение студенистых кладок яиц. Если они присутствуют, то кладку яиц осторожно удаляют. Ее переносят в небольшую чашку, содержащую пробу воды для культивирования. Кладку яиц используют для закладки нового сосуда для культивирования (например, 2 - 4 кладки яиц/сосуд) или используют для испытания токсичности.

10 Личинки первой стадии развития вылупляются через 2 - 3 сут.

Закладка новых культуральных сосудов

11 После получения культур закладывают новые сосуды для культивирования личинок каждую неделю или реже в зависимости от требований испытания, удаляя более старые сосуды после вылупления взрослых комаров. Используя такую систему, можно получить регулярную продукцию взрослых особей при минимальных усилиях.

Получение испытуемых растворов "M4" и "M7"

12 Elendt (1990) описал среду "M4". Среду "M7" готовят, как и среду "M4", за исключением веществ, приведенных в таблице А.1, концентрации которых в четыре раза ниже в среде "M7", чем в среде "M4". В литературе описано приготовление среды "M7" (Elendt, персональное сообщение). Испытуемый раствор не следует готовить в соответствии с Elendt и Bias (1990) для концентраций NaSiO₃·5H₂O, NaNO₃, KH₂PO₄ и K₂HPO₄, которые не подходят для приготовления стоковых растворов.

Приготовление среды "M7"

13 Каждый стоковый раствор (I) готовят по отдельности, и объединенный стоковый раствор (II) получают из данных стоковых растворов I (см. таблицу А.1). 50 мл объединенного стокового раствора (II) и определенное количество каждого стокового раствора макроэлементов, приведенных в таблице А.2, доводят до 1 л деионизированной водой с получением среды "M7". Стоковый раствор витаминов готовят добавлением трех витаминов к деионизированной воде, как показано в таблице А.3, и 0,1 мл объединенного стокового раствора витаминов добавляют к конечной среде "M7" непосредственно перед применением (стоковый раствор витаминов хранят замороженным небольшими порциями). Среду аэрируют и стабилизируют.

 

Библиография

 

1 BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Ed. by M. Streloke and H. Kopp. Berlin, 1995.

 

Таблица A.1

 

Стоковые растворы микроэлементов для среды M4 и M7

 

Стоковые растворы (I)	Количество, доведенное до 1 л деионизированной водой, мг	Для получения объединенного стокового раствора (II) смешивают следующие количества стокового раствора (I) и доводят до 1 л деионизированной водой, мл		Конечная концентрация в испытуемых растворах, мг/л
		M4	M7	M4	M7
H3BO3 <1>	57190	1,0	0,25	2,86	0,715
MnCl2·4 H2O <1>	7210	1,0	0,25	0,361	0,090
LiCl <1>	6120	1,0	0,25	0,306	0,077
RbCl <1>	1420	1,0	0,25	0,071	0,018
SrCl2·6 H2O <1>	3040	1,0	0,25	0,152	0,038
NaBr <1>	320	1,0	0,25	0,016	0,004
Na2MoO4·2H2O <1>	1260	1,0	0,25	0,063	0,016
CuCl2·2H2O <1>	335	1,0	0,25	0,017	0,004
ZnCl2	260	1,0	1,0	0,013	0,013
CoCl2·6H2O	200	1,0	1,0	0,010	0,010
Kl	65	1,0	1,0	0,0033	0,0033
Na2SeO3	43,8	1,0	1,0	0,022	0,0022
NH4Vo3	11,5	1,0	1,0	0,00058	0,000058
N2ЭДТА·2H2O <1> <2>	5000	20,0	5,0	2,5	0,625
FeSO4·7H2O <1> <2>	1991	20,0	5,0	1,0	0,249
<1> Данные вещества различаются в M4 и M7, как указывалось выше. <2> Данные растворы готовят по отдельности, затем сливают вместе и сразу же автоклавируют.

 

Таблица А.2

 

Стоковые растворы макроэлементов для среды M4 и M7

 

	Количество, доведенное до 1 л деионизированной водой, мг	Количество стоковых растворов макроэлемента, добавленное для приготовления среды M4 и M7, мл/л	Конечная концентрация в испытуемых растворах, мг/л
CaCl2·2 H2O	293800	1,0	293,8
MgSO4·2 H2O	246600	0,5	123,3
KCl	58000	0,1	5,8
NaHCO3	64800	1,0	64,8
NaSiO3·9 H2O	50000	0,2	10,0
NaNO3	2740	0,1	0,274
KH2PO4	1430	0,1	0,143
K2HPO4	1840	0,1	0,184

 

Таблица А.3

 

Стоковые растворы витаминов для среды M4 и M7

 

	Количество, доведенное до 1 л деионизированной водой, мг	Количество стоковых растворов витаминов, добавленное для приготовления среды M4 и M7, мл/л	Конечная концентрация в испытуемых растворах, мг/л
Тиамин гидрохлорид	750	0,1	0,075
Цианокобаламин (B12)	10	0,1	0,0010
Биотин	7,5	0,1	0,00075

 

Библиография

 

Elendt B.P. (1990): selenium deficiency in Crustacean. Protoplasma, 154, 25 - 33.

Elendt B.P. & W.-R. Bias (1990): trace nutrient deficiency in Daphnia magna cultured in standard medium for toxicity testing. Effects on the optimization of culture conditions on life history parameters of D. magna. Water Research 24(9), 1157 - 1167.