ГОСТ 33635-2015. Межгосударственный стандарт. Методы испытаний химической продукции, представляющей опасность для окружающей среды. Испытание токсичности на хирономидах с использованием обогащенного осадка

9 Проведение испытания

 

9.1 Условия испытания

9.1.1 Подготовка системы обогащенный осадок - вода

9.1.1.1 Для внесения испытуемого вещества используют процедуру обогащения, описанную в руководстве ОЭСР 207 "Определение острой токсичности для дождевых червей" [14]. Обогащенные осадки помещаются в сосуды и добавляют надосадочную воду с получением объемного соотношения осадок: вода 1:4 (см. 7.1 и 7.4). Высота слоя осадка должна находиться в пределах 1,5 - 3 см. Для предупреждения разделения компонентов осадка и ресуспендирования мелких частиц во время добавления испытуемой воды в водную колонку, осадок покрывают пластиковым диском и воду выливают на него, и после этого диск сразу же удаляют. Подходят также другие устройства.

9.1.1.2 Испытуемые сосуды покрывают, например, стеклянными пластинками. Если необходимо, то во время испытания уровень воды доводят до первоначального объема для компенсации потери воды за счет испарения. Для предупреждения отложения солей используют дистиллированную или деионизированную воду.

9.1.2 Стабилизация

После приготовления обогащенного осадка с надосадочной водой требуется обеспечить проникновение испытуемого вещества из осадка в водную фазу [3], [4], [6], [13]. Предпочтительно это проводят при температуре и аэрации, используемых при испытании. Соответствующее время уравновешивания является специфическим для осадка и химического вещества и может находиться в пределах от нескольких часов до суток, а в редких случаях до нескольких недель (4 - 5 нед). Поскольку за это время может произойти деградация многих химических веществ, то не ожидают окончания уравновешивания, но рекомендуемый период уравновешивания обычно составляет 48 ч. В конце этого дополнительного периода уравновешивания определяют концентрацию испытуемого вещества в надосадочной жидкости, поровой воде и осадке по меньшей мере при самой высокой концентрации и при одной более низкой концентрации (см. 9.3.1.1). Данные аналитические измерения испытуемого вещества позволяют рассчитать массовый баланс и выразить результаты на основе установленных концентраций.

9.1.3 Внесение тестовых организмов

9.1.3.1 За 4 - 5 сут до внесения тестовых организмов в испытуемые сосуды отбирают кладки яиц из культур и помещают в небольшие сосуды с культуральной средой. Используют выдержанную среду из исходной культуры или свежеприготовленную среду. При использовании последней в культуральную среду добавляют небольшое количество корма, например зеленые водоросли и/или несколько капель фильтрата мелко измельченной суспензии хлопьевидного корма для рыб (см. приложение А). Используют только недавно отложенные кладки яиц. Обычно личинки начинают вылупляться через пару суток после кладки (2 - 3 сут - Chironomus riparius при 20 °C, 1 - 4 сут - Chironomus tentans при 23 °C и Chironomus yoshimatui при 25 °C), и рост личинок происходит в четыре стадии развития, каждая продолжительностью 4 - 8 сут. В испытании используют личинок первой стадии развития (2 - 3 или 1 - 4 сут после вылупления). Стадию развития комаров определяют по ширине головной капсулы [6].

9.1.3.2 В каждый испытуемый сосуд, содержащий обогащенный осадок и воду, произвольно вносят 20 личинок первой стадии развития, используя пипетку с тупым кончиком. Аэрацию воды останавливают во время внесения личинок в испытуемые сосуды и еще на 24 ч после этого (см. 9.1.3.1 и 9.1.8.1). Согласно выбранному дизайну испытания (см. 8.1.2 и 8.2.1) количество используемых личинок на каждую концентрацию составляет не менее 60 для установления точки EC и не менее 80 для установления NOEC.

9.1.4 Испытуемые концентрации

9.1.4.1 Испытание по подбору диапазона концентраций необходимо для определения диапазона предельных концентраций в конечном испытании. Для этой цели используют ряд широко разнесенных концентраций испытуемого вещества. Для обеспечения одинаковой плотности хирономид на поверхности, используемой для конечного испытания, хирономиды подвергают воздействию каждой концентрации испытуемого вещества в течение периода времени, позволяющего установить соответствующие испытуемые концентрации, и для этого не требуется повторности.

9.1.4.2 Испытуемые концентрации для конечного опыта определяют на основе результатов испытания по подбору диапазона концентраций. Используют и выбирают не менее пяти концентраций, как описано в 8.1.1 - 8.2.1.

9.1.5 Контроли

В испытание включают контрольные сосуды, не содержащие испытуемого химического вещества, но содержащие осадок, при соответствующем количестве повторностей (см. 8.1.2 - 8.2.1). В том случае, если использован растворитель для внесения испытуемого вещества (см. 7.5.1), следует добавить контроль на растворитель с осадком.

9.1.6 Тест-система

Используют статические системы. В исключительных случаях используются полустатические или проточные системы с периодическим или постоянным обновлением надосадочной воды, например, если показатели качества воды становятся непригодными для тестового организма, или нарушается химическое равновесие (например, уровни растворенного кислорода падают слишком низко, концентрация выделенных продуктов повышается слишком высоко или минеральные вещества вымываются из осадка и влияют на значение pH и/или жесткость воды). Однако подходят и могут быть предпочтительными другие методы улучшения качества надосадочной воды, такие как аэрация.

9.1.7 Корм

Личинок кормят предпочтительно каждый день или не менее трех раз в неделю. Корм для рыб (суспензия в воде или мелко измельченный корм, например Tetra-Min или Tetra-Phyll; подробное описание см. в приложении А) в количестве 0,25 - 0,5 мг (0,35 - 0,5 мг для C. yoshimatui) на личинку в сутки является достаточным для личинок раннего возраста в течение первых 10 сут. Немного больше корма требуется для личинок более старшего возраста: 0,5 - 1 мг на личинку в сутки является достаточным для остального периода испытания. Количество корма снижают во всех обработках и контроле, если отмечен рост грибов или в контроле наблюдается гибель личинок. Если невозможно остановить рост грибов, то испытание повторяют заново. При испытании веществ с высокой адсорбирующей способностью (например, с log K_ow > 5) или веществ, ковалентно связывающихся с осадком, количество корма, необходимое для обеспечения выживаемости и естественного роста организмов, добавляют к искусственному осадку до периода стабилизации. Для этого используют растительный материал вместо корма для рыб, например добавляют 0,5% (сухая масса) мелко измельченных листьев жгучей крапивы (Urtica dioeca), шелковицы (Morus alba), клевера ползучего или белого (Trifolium repens), шпината (Spinacia oleracea) или другого растительного материала (Cerophyl или аотфа-целлюлоза).

9.1.8 Условия инкубации

9.1.8.1 Проводят легкое аэрирование надосадочной воды в испытуемых сосудах предпочтительно в течение 24 ч после внесения личинок и продолжают в течение всего испытания (следует соблюдать осторожность в отношении того, что концентрация растворенного кислорода не должна снижаться ниже 60% ASV). Аэрацию проводят через стеклянную пастеровскую пипетку, зафиксированную на 2 - 3 см выше слоя осадка (т.е. один или несколько пузырьков/сек). В случае испытания летучих химических веществ аэрацию системы осадок - вода не проводят.

9.1.8.2 Испытание проводят при постоянной температуре (20 +/- 2) °C. Для C. tentas и C. yoshimatui рекомендуются температуры соответственно (23 +/- 2) °C и (25 +/- 2) °C. Используют 16-часовой световой период, и интенсивность света должна составлять от 500 до 1000 лк.

9.1.9 Продолжительность воздействия

Воздействие начинается с внесения личинок в обогащенные и контрольные сосуды. Максимальная продолжительность воздействия составляет 28 сут для C. riparis и C. yoshimatui и 65 сут для C. tentas. Если комары вылупляются раньше, то испытание можно закончить минимум через 5 сут после вылупления последней взрослой особи в контроле.