ГОСТ 33505-2015. Межгосударственный стандарт. Карантин растений. Методы выявления и идентификации потивируса шарки слив

4. Общие положения

4.1 Для выявления и идентификации потивируса шарки слив применяют отборочные и подтверждающие анализы, схема применения которых представлена на рисунке 1.

┌─────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐

│ Растительный образец, визуальный метод │

└────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────┘

┌────────────────────────────────────┴────────────────────────────────────┐

│ Отборочные анализы│

│┌───────────────────┐ ┌─────────────────────────┐ ┌────────────────────┐ │

││ │ │ Серологические анализы │ │ │ │

││Тесты на древесных │ │ с универсальными │ │Молекулярные анализы│ │

││ и травянистых │ │ моноклональными или │ │ с универсальными │ │

││ индикаторных │ │ поликлональными │ │праймерами и зондами│ │

││ растениях │ │ антителами │ │ │ │

││ │ │(DAS-ELISA или TAS-ELISA)│ │ │ │

│└────┬──────────┬───┘ └───────────┬─────────────┘ └─────────┬──────────┘ │

└─────┼──────────┼─────────────────┼─────────────────────────┼────────────┘

┌─────┼──────────┼─────────────────┼─────────────────────────┼────────────┐

│ V V │ Подтверждающие анализы │

│┌────┴────┐┌────┴────┐ V V │

││Типичные ││ Без │ ┌────────┴─────────┐ ┌─────────────┴───────────┐│

││симптомы ││симптомов│ │ │ │ Серологические анализы ││

│└────┬────┘└────┬────┘ │ Молекулярные │ │ с универсальными ││

│ V V │ анализы │ │ моноклональными ││

│┌────┴────┐┌────┴────┐ │ с универсальными │ │ или поликлональными ││

││Подтверж-││Серологи-│ │ праймерами │ │ антителами ││

││дение ││ческие │ │ и зондами │ │(DAS-ELISA или TAS-ELISA)││

││серологи-││или моле-│ └────────┬─────────┘ └─────────────┬───────────┘│

││ческими ││кулярные │ V │ │

││или моле-││отбороч- ├┐ ┌────────┴─────────┐ │ │

││кулярными││ные ││ │ Положительные ├<──────────────┘ │

││отбороч- ││анализы │└─>┤результаты в обоих│ │

││ными ││ │ │ анализах │ │

││анализами││ │ │ │ │

│└────┬────┘└─────────┘ └────────┬─────────┘ ┌──────────────────────┐ │

│ V │ │ Образец заражен │ │

│┌────┴───────────────┐ └──────────>┤ потивирусом шарки │ │

││ Положительные ├───────────────────────>┤ слив │ │

││ результаты в одном │ └─────────────┬────────┘ │

││ из подтверждающих │ │ │

││ анализов │ │ │

│└────────────────────┘ │ │

│ │ │

└────────────────────────────────────────────────────────────┼────────────┘

┌────────────────────────────────────────────────────────────┼────────────┐

│Идентификация штамма V │

│ ┌────────────────────────────┴─────────┐ │

│ ┌───────────────┤ Серологический анализ (TAS-ELISA) │ │

│ V │ со штаммспецифичными моноклональными │ │

│ ┌─────────┴─────────────┐ │ антителами, молекулярные анализы │ │

│ │ Идентификация штамма │ │ со штаммспецифичными праймерами │ │

│ └─────────┬─────────────┘ │ │ │

│ V └──────────────────────────────────────┘ │

│ ┌─────────────┴──────────────────────────────────────────────────┐ │

│ │ Секвенирование гена белка оболочки при первичном обнаружении │ │

│ └────────────────────────────────────────────────────────────────┘ │

└─────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘

Рисунок 1 - Схема выявления и идентификации

потивируса шарки слив

4.2 В качестве отборочных анализов используют биологические тесты на древесных и травянистых индикаторных растениях по 8.2, серологические анализы по 8.3 или молекулярные анализы по 8.4.

4.3 Результаты биологических тестов подтверждают дополнительными серологическими или молекулярными отборочными анализами.

Образец считают зараженным потивирусом шарки слив, если наличие симптомов на индикаторных растениях подтверждено положительными результатами серологических или молекулярных отборочных анализов.

4.4 Серологические отборочные анализы проводят твердофазным ИФА в модификациях DAS-ELISA и TAS-ELISA с универсальными моноклональными или поликлональными антителами, позволяющими выявлять все штаммы потивируса шарки слив.

Положительный результат в серологическом отборочном анализе проверяют в подтверждающем молекулярном анализе с универсальными праймерами и зондами на основе ПЦР в различных модификациях или методом гибридизации нуклеиновых кислот, позволяющими выявлять все штаммы потивируса шарки слив.

Образец считают зараженным потивирусом шарки слив при наличии положительных результатов в обоих анализах.

4.5 В случае использования в качестве отборочных анализов молекулярных методов положительный результат проверяют в подтверждающем серологическом анализе, который проводят твердофазным ИФА в модификациях DAS-ELISA и TAS-ELISA с универсальными моноклональными или поликлональными антителами, позволяющими выявлять все штаммы потивируса шарки слив.

Образец считают зараженным потивирусом шарки слив при наличии положительных результатов в обоих анализах.

4.6 При выявлении потивируса шарки слив отборочными и подтверждающими анализами рекомендуется проводить идентификацию штамма вируса твердофазным ИФА в модификации TAS-ELISA со штаммспецифичными моноклональными антителами или молекулярными методами с праймерами и зондами, специфичными к штаммам потивируса шарки слив.

4.7 При первичном обнаружении потивируса шарки слив рекомендуется провести секвенирование гена белка оболочки для сравнения с сиквенсами изолятов потивируса шарки слив в базах данных генетических последовательностей.

4.8 Исходный образец плодов или листьев растений с этикетками, образцы РНК и экстракты сока, полученные из образцов растений, хранят в пробирках при температуре минус 80 °C не менее 12 мес; продукты амплификации ПЦР - при температуре минус 20 °C не менее 12 мес.