ГОСТ 33505-2015. Межгосударственный стандарт. Карантин растений. Методы выявления и идентификации потивируса шарки слив
8.4. Молекулярные методы выявления и идентификации
8.4.1 Сущность методов
Сущность молекулярных методов исследования потивируса шарки слив заключается в выявлении вируса в образце путем многократного избирательного копирования определенного участка нуклеиновой кислоты при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro) в целях обнаружения чужеродной для образца РНК вируса.
8.4.2 Подготовка к исследованию
8.4.2.1 Для ОТ рекомендуется использовать готовые наборы реагентов (мастер-миксы). Приготовление реакционных смесей осуществляют с помощью микроцентрифуги-встряхивателя в соответствии с инструкциями изготовителей.
8.4.2.2 Для ПЦР рекомендуется использовать готовые наборы реагентов (мастер-миксы). Приготовление реакционных смесей осуществляют с помощью микроцентрифуги-встряхивателя в соответствии с инструкциями изготовителей.
8.4.2.3 Подготовка проб
При проведении классической ПЦР с ОТ, ПЦР с ОТ в формате FLASH и ПЦР с ОТ в режиме реального времени из исследуемого образца растения, отобранного по 7.2.1, проводят выделение РНК с использованием наборов реагентов для выделения нуклеиновых кислот в соответствии с инструкциями изготовителей.
При проведении иммуноспецифической ПЦР с ОТ исследуемый образец растения, отобранный по 7.2.1, массой 1 г гомогенизируют в пластиковом контейнере с 20 см3 экстрагирующего буферного раствора по 7.1.1.3 (вариант 1) на гомогенизаторе в течение 2 - 5 мин или с помощью фарфоровой ступки и пестика до получения однородной суспензии.
8.4.3 Проведение исследования для универсального выявления всех изолятов потивируса шарки слив
8.4.3.1 ПЦР с ОТ
Для универсального выявления всех изолятов потивируса шарки слив используют пару праймеров P1/P2 или пару праймеров 3'NCR sense/3'NCR antisense (см. 6.5).
Реакцию ОТ проводят при термоциклических условиях, указанных в таблице 3.
Таблица 3
Термоциклические условия для проведения реакции ОТ
Первый этап ОТ | |||
Реакция ОТ | Режим ОТ | ||
Вода стерильная | 3 мм3 | При температуре 70 °C в течение 5 мин | |
Праймеры | Random dN10 | 0,5 мм3 | |
Oligo dT17 | 0,5 мм3 | При температуре 4 °C в течение 5 мин | |
РНК | 5 мм3 | ||
Второй этап ОТ | |||
Вода стерильная | 1 мм3 | При температуре 40 °C в течение 60 мин | |
5x буферный раствор для синтеза первой цепи кДНК | 4 мм3 | ||
dNTPs | 2 мм3 | При температуре 70 °C в течение 10 мин | |
ДТТ | 2 мм3 | ||
Ревертаза MMLV | 2 мм3 | ||
Примечание - При использовании наборов реагентов с модифицированной ревертазой MMLV или ревертазой AMV термоциклические условия реакции корректируют в соответствии с инструкциями изготовителей.
ПЦР проводят на амплификаторе при термоциклических условиях, указанных в таблицах 4 и 5.
Таблица 4
Термоциклические условия для ПЦР с ОТ с праймерами P1/P2
Температура, °C | Время | Число циклов |
95 | 15 мин | 1 |
95 | 30 с | 35 |
60 | 30 с | |
72 | 1 мин | |
72 | 10 мин | 1 |
4 | Хранение | - |
Таблица 5
Термоциклические условия для ПЦР с ОТ с праймерами
3'NCR sense/3'NCR antisense
Температура, °C | Время | Число циклов |
95 | 15 мин | 1 |
95 | 30 с | 35 |
61 | 30 с | |
72 | 1 мин | |
72 | 10 мин | 1 |
4 | Хранение | - |
Примечание - При использовании комплектов реагентов с другими типами Taq-полимеразы термоциклические условия корректируют в соответствии с инструкциями изготовителей.
Анализ результатов ПЦР осуществляют с применением горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле. При положительном анализе обнаруживают ампликоны молекулярной массой 243 п.н. для пары праймеров P1/P2 или 220 п.н. для пары праймеров 3'NCR sense/3'NCR antisense.
Электрофорез продуктов амплификации
При электрофорезе продуктов амплификации готовят 2%-ный агарозный гель в буферном растворе 0,5x ТАЕ по 7.1.3.2. Наносят капли загрузочного буферного раствора по 7.1.3.3 объемом 3 мм3 на пленку Парафилм, добавляют к капле 20 мм3 продукта амплификации и тщательно перемешивают, вносят продукты амплификации, включая положительный и отрицательный контроли, в лунки геля. В первую лунку геля вносят ДНК-маркер с молекулярной массой 100 п.н.
Проводят электрофорез в течение 20 мин при напряжении 120 В (для геля 15 x 10 см) или в течение 40 мин при напряжении 160 В (для геля 15 x 25 см) в буферном растворе 0,5x ТАЕ. Погружают гель в раствор бромистого этидия по 7.1.3.4 на 20 мин. Просматривают гель на ультрафиолетовом трансиллюминаторе.
8.4.3.2 Иммуноспецифическая ПЦР с ОТ
Вносят иммуноглобулины в пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 см3. Для этого готовят рекомендуемое разведение специфичных поликлональных антител или моноклональных антител 5B-IVIA в карбонатном буферном растворе pH 9,6.
Вносят по 100 мм3 раствора антител в каждую пробирку типа Эппендорф. Инкубируют в термостате 3 ч при температуре 37 °C. Дважды промывают пробирки, используя 150 мм3 промывочного буферного раствора.
Готовят растительный экстракт с использованием экстрагирующего буферного раствора, осветляют 100 мм3 растительного экстракта центрифугированием (в течение 5 мин при скорости 2000 об/мин) и вносят в пробирки типа Эппендорф с адсорбированными антителами, инкубируют пробирки в течение 2 ч на льду или в термостате при температуре 37 °C. Пробирки трижды промывают, используя 150 мм3 промывочного буферного раствора.
Проводят ОТ в соответствии с термоциклическими условиями, приведенными в таблице 3.
Готовят реакционную смесь для ПЦР в соответствии с 8.4.2.2 и вносят ее в пробирки с нанесенными антителами. ПЦР и анализ результатов проводят в соответствии с 8.4.3.1.
8.4.3.3 ПЦР с ОТ в режиме реального времени
ПЦР с ОТ в режиме реального времени на выявление потивируса шарки слив проводят с использованием соответствующих наборов реагентов в соответствии с инструкциями изготовителей.
8.4.3.4 ПЦР с ОТ в формате FLASH
ПЦР с ОТ в формате FLASH на выявление потивируса шарки слив проводят с использованием соответствующих наборов реагентов в соответствии с инструкциями изготовителей.
8.4.4 Проведение исследования для идентификации штаммов потивируса шарки слив
Идентификацию штаммов PPV-D, PPV-M, PPV-Rec, PPV-C, PPV-CR и PPV-W потивируса шарки слив проводят методом ПЦР с ОТ.
8.4.4.1 Идентификация штаммов PPV-D и PPV-M
Для специфического выявления штамма PPV-D используют пару праймеров P1/PD (см. 6.5).
Для специфического выявления штамма PPV-M используют пару праймеров P1/PM (см. 6.5).
Проводят ОТ в соответствии с термоциклическими условиями, приведенными в таблице 3.
Реакционную смесь для ПЦР готовят в соответствии с 8.4.2.2.
ПЦР проводят на амплификаторе при термоциклических условиях, указанных в таблице 6.
Таблица 6
Термоциклические условия для ПЦР с ОТ
с праймерами P1/PD и P1/PM
Температура, °C | Время | Число циклов |
95 | 15 мин | 1 |
95 | 30 с |
|
60 | 30 с | 35 |
72 | 1 мин |
|
72 | 10 мин | 1 |
4 | Хранение | - |
Примечание - При использовании наборов реагентов с другими типами Taq-полимеразы термоциклические условия корректируют в соответствии с инструкциями изготовителей.
Анализ результатов ПЦР осуществляют с применением горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле. При положительном анализе обнаруживают ампликоны молекулярной массой 198 п.н.
8.4.4.2 Идентификация штамма PPV-Rec
Для специфического выявления штамма PPV-Rec используют пару праймеров mD5/mM3 (см. 6.5).
Проводят ОТ в соответствии с термоциклическими условиями, приведенными в таблице 3.
Реакционную смесь для ПЦР готовят в соответствии с 8.4.2.2.
ПЦР проводят на амплификаторе при термоциклических условиях, указанных в таблице 7.
Таблица 7
Термоциклические условия для ПЦР с ОТ с праймерами mD5/mM3
Температура, °C | Время | Число циклов |
95 | 15 мин | 1 |
95 | 30 с | 35 |
60 | 30 с | |
72 | 1 мин | |
72 | 10 мин | 1 |
4 | Хранение | - |
Примечание - При использовании комплектов реагентов с другими типами Taq-полимеразы термоциклические условия корректируют в соответствии с инструкциями изготовителей.
Анализ результатов ПЦР осуществляют с применением горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле. При положительном анализе обнаруживают ампликоны молекулярной массой 605 п.н.
8.4.4.3 Идентификация штамма PPV-C
Для специфического выявления штамма PPV-C используют пару праймеров CSoC-2/HSoC-2 (см. 6.5).
ОТ проводят в соответствии с термоциклическими условиями, приведенными в таблице 3.
Реакционную смесь для ПЦР готовят в соответствии с 8.4.2.2.
ПЦР проводят на амплификаторе при термоциклических условиях, указанных в таблице 8.
Таблица 8
Термоциклические условия для ПЦР с ОТ
с праймерами CSoC-2/HSoC-2
Температура, °C | Время | Число циклов |
95 | 15 мин | 1 |
95 | 30 с | 35 |
62 | 30 с | |
72 | 30 с | |
72 | 5 мин | 1 |
4 | Хранение | - |
Примечание - При использовании комплектов реагентов с другими типами Taq-полимеразы термоциклические условия корректируют в соответствии с инструкциями изготовителей.
Анализ результатов ПЦР осуществляют с применением горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле. При положительном анализе обнаруживают ампликоны молекулярной массой 193 п.н.
8.4.4.4 Идентификация штамма PPV-CR
Для специфического выявления штамма PPV-CR используют пару праймеров CR8597F/CR9023R (см. 6.5).
Проводят ОТ в соответствии с термоциклическими условиями, приведенными в таблице 3.
Реакционную смесь для ПЦР готовят в соответствии с 8.4.2.2.
ПЦР проводят на амплификаторе при термоциклических условиях, указанных в таблице 9.
Таблица 9
Термоциклические условия для ПЦР с ОТ
с праймерами CR8597F/CR9023R
Температура, °C | Время | Число циклов |
95 | 15 мин | 1 |
95 | 30 с | 35 |
55 | 30 с | |
72 | 1 мин | |
72 | 10 мин | 1 |
4 | Хранение | - |
Примечание - При использовании комплектов реагентов с другими типами Taq-полимеразы термоциклические условия корректируют в соответствии с инструкциями изготовителей.
Анализ результатов ПЦР осуществляют с применением горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле. При положительном анализе обнаруживают ампликоны молекулярной массой 427 п.н.
8.4.4.5 Идентификация штамма PPV-W
Для специфического выявления штамма PPV-W используют пару праймеров W8328F/W8711R (см. 6.5).
Проводят ОТ в соответствии с термоциклическими условиями, приведенными в таблице 3.
Реакционную смесь для ПЦР готовят в соответствии с 8.4.2.2.
ПЦР проводят на амплификаторе при термоциклических условиях, указанных в таблице 10.
Таблица 10
Термоциклические условия для ПЦР с ОТ
с праймерами W8328F/W8711R
Температура, °C | Время | Число циклов |
95 | 15 мин | 1 |
92 | 30 с | 35 |
62 | 30 с | |
72 | 1 мин | |
72 | 10 мин | 1 |
4 | Хранение | - |
Примечание - При использовании комплектов реагентов с другими типами Taq-полимеразы термоциклические условия корректируют в соответствии с инструкциями изготовителей.
Анализ результатов ПЦР осуществляют с применением горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле. При положительном анализе обнаруживают ампликоны молекулярной массой 384 пар п.н.
Подписаться на обновления