ГОСТ 33505-2015. Межгосударственный стандарт. Карантин растений. Методы выявления и идентификации потивируса шарки слив

8.3. Серологические методы выявления и идентификации

8.3.1 Сущность методов

Серологические методы исследования потивируса шарки слив представлены твердофазным ИФА в модификациях DAS-ELISA и TAS-ELISA.

Сущность методов ИФА заключается в выявлении в образце иммунного комплекса "антиген-антитело" к потивирусу шарки слив путем присоединения к одному из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией в сравнении с положительными и отрицательными контролями.

8.3.2 Подготовка проб

Исследуемый образец растения, отобранный по 7.2.1, массой 1 г гомогенизируют в пластиковом контейнере с 20 см³ экстрагирующего буферного раствора по 7.1.1.3 на гомогенизаторе в течение 2 - 5 мин или с помощью фарфоровой ступки и пестика до получения однородной суспензии и осветляют центрифугированием в течение 5 мин при скорости 2000 об/мин с охлаждением до температуры 5 °C.

8.3.3 Проведение исследования

8.3.3.1 Твердофазный ИФА в модификации DAS-ELISA

Твердофазный ИФА в модификации DAS-ELISA на выявление потивируса шарки слив (в том числе с использованием тест-системы биотин/стрептавидин) проводят с использованием тест-систем и специфических моноклональных антител 5B-IVIA или поликлональных антител для универсального выявления всех изолятов потивируса шарки слив в соответствии с инструкциями изготовителей.

Готовят рекомендуемое разведение кроличьих поликлональных антител или моноклональных антител 5B-IVIA в карбонатном буферном растворе по 7.1.2.2 и вносят по 200 мм³ в каждую лунку планшета, используя дозаторы со сменными одноразовыми наконечниками.

Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °C в течение 4 ч или при температуре 4 °C в течение 16 ч и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором по 7.1.1.2.

Вносят в каждую лунку планшета по 200 мм³ пробы растительного экстракта, полученной по 8.3.2. Используют по две лунки для каждого образца и для положительного контроля и не менее двух лунок для отрицательного контроля. Лунки маркируют.

Планшет закрывают и инкубируют в холодильной камере при температуре 4 °C в течение 16 ч и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.

Для универсального выявления всех изолятов потивируса шарки слив готовят рекомендуемое разведение конъюгата в буферном растворе для конъюгата по 7.1.2.4.

Вносят в каждую лунку планшета по 200 мм³ поликлональных антител или моноклональных антител 5B-IVIA, конъюгированных с щелочной фосфатазой или биотином.

Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °C в течение 2 - 4 ч в зависимости от рекомендаций изготовителя тест-системы и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.

В случае если антитела мечены биотином, используют рекомендуемые разведения стрептавидин-щелочнофосфатазного конъюгата. Вносят по 200 мм³ в каждую лунку планшета.

Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °C в течение 30 мин и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.

Для обеих тест-систем (традиционной системы и системы биотин/стрептавидин) готовят раствор субстрата для щелочной фосфатазы (1 мг p-нитрофенилфосфата на 1 см³ субстратного буферного раствора по 7.1.2.5) и вносят по 200 мм³ в каждую лунку планшета.

Планшет закрывают и инкубируют при температуре от 18 °C до 25 °C, затем считывают показания на иммуноферментном фотометрическом анализаторе при длине волны 405 нм через 30, 60, 90 и 120 мин.

8.3.3.2 Твердофазный ИФА в модификации TAS-ELISA

Твердофазный ИФА в модификации TAS-ELISA на выявление потивируса шарки слив проводят с использованием тест-систем и специфических моноклональных антител 5B-IVIA для универсального выявления всех изолятов потивируса шарки слив в соответствии с инструкциями изготовителей.

Характеризацию и типизацию штаммов PPV-D, PPV-M, PPV-C и PPV-EA осуществляют с использованием специфических моноклональных антител, специфичных к этим штаммам.

Готовят рекомендуемое разведение кроличьих поликлональных иммуноглобулинов к потивирусу шарки слив в карбонатном буферном растворе по 7.1.2.2 и вносят по 200 мм³ в каждую лунку планшета, используя дозаторы со сменными одноразовыми наконечниками.

Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °C в течение 4 ч или при температуре 4 °C в течение 16 ч и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором по 7.1.1.2.

Вносят в каждую лунку планшета по 200 мм³ пробы растительного экстракта, полученной по 8.3.2. Используют по две лунки для каждого образца и для положительного контроля и не менее двух лунок для отрицательного контроля. Лунки маркируют.

Планшет закрывают и инкубируют в холодильной камере при температуре 4 °C в течение 16 ч и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.

Для универсального выявления всех изолятов потивируса шарки слив готовят рекомендуемые разведения моноклональных антител 5B-IVIA в буферном растворе для конъюгата по 7.1.2.4 и вносят по 200 мм³ раствора антител в каждую лунку планшета.

Для специфического выявления штамма PPV-D с использованием моноклональных антител 4D, штамма PPV-M с использованием моноклональных антител AL, штамма PPV-C с использованием моноклональных антител Ac, штамма PPV-EA с использованием моноклональных антител EA готовят рекомендуемые разведения соответствующих моноклональных антител в буферном растворе для конъюгата и вносят по 200 мм³ раствора антител в каждую лунку планшета.

Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °C в течение 2 ч и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.

Вносят в лунки планшета антимышиные иммуноглобулины, конъюгированные с щелочной фосфатазой, готовят рекомендуемое разведение конъюгата в буферном растворе для конъюгата. Вносят по 200 мм³ в каждую лунку планшета.

Планшет закрывают и инкубируют в термостатируемом встряхивателе при температуре 37 °C в течение 2 ч и трижды промывают лунки планшета промывочным буферным раствором.

Готовят раствор субстрата для щелочной фосфатазы (1 мг p-нитрофенилфосфата на 1 см³ субстратного буферного раствора по 7.1.2.5).

Планшет закрывают и инкубируют при температуре от 18 °C до 25 °C, затем считывают показания на иммуноферментном фотометрическом анализаторе при длине волны 405 нм через 30, 60, 90 и 120 мин.

8.3.4 Обработка результатов

Результат исследования считают отрицательным, если значение абсорбции образца не более двукратного значения абсорбции в отрицательном контроле.