ГОСТ 33505-2015. Межгосударственный стандарт. Карантин растений. Методы выявления и идентификации потивируса шарки слив

7. Подготовка к исследованиям

 

7.1. Приготовление растворов

7.1.1 Приготовление растворов для теста на травянистых индикаторных растениях

7.1.1.1 Приготовление натрий-фосфатного буферного раствора с pH 7,3

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ с 800 см³ дистиллированной воды растворяют 8 г хлорида натрия, 0,2 г хлорида калия, 2,9 г гидрофосфат додекагидрата натрия и 0,2 г дигидроортофосфата калия. Доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Проверяют pH буферного раствора, который должен быть (7,3 +/- 0,1) ед. pH.

Срок хранения натрий-фосфатного буферного раствора в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 5 сут.

7.1.1.2 Приготовление промывочного буферного раствора

В мерную колбу вместимостью 1000 см³ наливают 800 см³ натрий-фосфатного буферного раствора по 7.1.1.1 и добавляют 0,5 см³ твина 20. Доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Срок хранения промывочного буферного раствора в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 5 сут.

7.1.1.3 Приготовление экстрагирующего буферного раствора

Вариант 1

В мерную колбу вместимостью 500 см³ наливают 400 см³ промывочного буферного раствора по 7.1.1.2, добавляют 10 г поливинилпирролидона и 1 г яичного или бычьего сывороточного альбумина. Доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Вариант 2

В мерную колбу вместимостью 500 см³ наливают 400 см³ промывочного буферного раствора по 7.1.1.2, добавляют 10 г поливинилпирролидона и 2,25 г ДИЕКА молярной концентрации 0,01 моль/дм³. Доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Срок хранения экстрагирующего буферного раствора в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 4 °C - не более 2 сут.

7.1.1.4 Приготовление стабилизирующего HEPES буферного раствора с pH 8,0

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ с 825,7 см³ дистиллированной воды растворяют 238,3 г HEPES молярной концентрации 0,02 моль/дм³. Доводят 10%-ным раствором гидроокиси калия pH до 8,0 и перемешивают.

Срок хранения HEPES буферного раствора в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 5 сут.

7.1.1.5 Приготовление фосфатного буферного раствора молярной концентрации 0,03 моль/дм³, pH 8,5

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ с 500 см³ дистиллированной воды растворяют 3,5 г дигидрофосфата калия и 4,5 г хлорида натрия. Доводят pH до 8,5 с помощью смеси равных объемов 10%-ного раствора ортофосфорной кислоты и дистиллированной воды и перемешивают.

Срок хранения фосфатного буферного раствора в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 10 сут.

7.1.1.6 Приготовление стабилизирующего раствора с ДИЕКА, дифенилдитиомочевиной и кофеином

В мерной колбе вместимостью 200 см³ с 100 см³ фосфатного буферного раствора по 7.1.1.5 растворяют 3,38 г ДИЕКА молярной концентрации 0,015 моль/дм³, 3,42 г дифенилдитиомочевины молярной концентрации 0,015 моль/дм³ и 5,82 г кофеина молярной концентрации 0,03 моль/дм³ и перемешивают.

Срок хранения раствора с ДИЕКА, дифенилдитиомочевиной и кофеином в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 5 сут.

7.1.1.7 Приготовление 1%-ного стабилизирующего раствора никотина

В мерной колбе вместимостью 100 см³ с 90 см³ дистиллированной воды растворяют 10 см³ никотина и перемешивают.

Раствор используют немедленно, хранение не допускается.

7.1.1.8 Допускается использование готовых буферных растворов и стабилизирующих смесей в соответствии с инструкциями изготовителей.

7.1.2 Приготовление растворов для исследований серологическими методами

7.1.2.1 Для проведения исследований потивируса шарки слив серологическими методами используют натрий-фосфатный буферный раствор по 7.1.1.1, промывочный буферный раствор по 7.1.1.2, экстрагирующий буферный раствор по 7.1.1.3, а также следующие буферные растворы.

7.1.2.2 Приготовление карбонатного буферного раствора с pH 9,6

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ с 800 см³ дистиллированной воды растворяют 1,59 г карбоната натрия и 2,93 г гидрокарбоната натрия. Доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Проверяют pH буферного раствора, который должен быть (9,6 +/- 0,1) ед. pH.

Срок хранения карбонатного буферного раствора в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 10 сут.

7.1.2.3 Приготовление 0,5%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина

В мерной колбе вместимостью 100 см³ с 99 см³ дистиллированной воды растворяют 0,5 см³ бычьего сывороточного альбумина и перемешивают.

Срок хранения 0,5%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 1 сут.

7.1.2.4 Приготовление буферного раствора для конъюгата

В мерной колбе вместимостью 200 см³ с 100 см³ натрий-фосфатного буферного раствора по 7.1.1.1 растворяют 0,5 г 0,5%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина.

Срок хранения буферного раствора для конъюгата в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 3 сут.

7.1.2.5 Приготовление субстратного буферного раствора с pH 9,8

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ с 800 см³ дистиллированной воды растворяют 97 см³ диэтаноламина. Доводят концентрированной соляной кислотой pH до (9,8 +/- 0,1) ед. pH, затем доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Срок хранения субстратного буферного раствора в колбе в холодильной камере при температуре от 2 °C до 4 °C - не более 10 сут.

7.1.2.6 Допускается использование готовых буферных растворов в соответствии с инструкциями изготовителей.

7.1.3 Приготовление растворов для исследований молекулярными методами

7.1.3.1 Для проведения исследований потивируса шарки слив молекулярными методами используют натрий-фосфатный буферный раствор по 7.1.1.1, промывочный буферный раствор по 7.1.1.2 без добавления твина-20, экстрагирующий буферный раствор по 7.1.1.3 (вариант 1), карбонатный буферный раствор по 7.1.2.2, а также следующие буферные растворы.

7.1.3.2 Приготовление буферного раствора 0,5x ТАЕ

В мерной колбе вместимостью 1000 см³ с 100 см³ ЭДТА молярной концентрации 0,5 моль/дм³, pH 8,0, растворяют 242 г Трис и 58 см³ ледяной уксусной кислоты. Доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Срок хранения буферного раствора 0,5x ТАЕ в колбе при температуре от 18 °C до 25 °C - не более 7 сут, в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 30 сут.

7.1.3.3 Приготовление загрузочного буферного раствора

В мерной колбе вместимостью 100 см³ с 7 см³ дистиллированной воды растворяют 0,025 г бромфенолового голубого и 3 см³ глицерина.

Загрузочный буферный раствор используют немедленно, хранение не допускается.

7.1.3.4 Приготовление раствора бромистого этидия

В мерной колбе вместимостью 100 см³ с 100 см³ дистиллированной воды растворяют 1 г бромистого этидия.

Срок хранения раствора бромистого этидия в посуде из темного стекла в холодильной камере при температуре от 2 °C до 5 °C - не более 12 мес.

7.1.3.5 Допускается использование готовых буферных растворов в соответствии с инструкциями изготовителей.