ГОСТ ISO 7218-2015. Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

Приложение D

(обязательное)

 

ПОДСЧЕТ КОЛОНИЙ В СЛУЧАЕ ДВУХ ЧАШЕК И ОДНОГО РАЗВЕДЕНИЯ

 

D.1 Введение

Настоящее приложение устанавливает методы расчета и выражения результатов для подсчета с использованием на одно разведение.

Применяют все требования и рекомендации, установленные в 10.3.

В настоящем приложении представлены только отличающиеся разделы и те разделы, которые необходимы для понимания.

D.2 Подсчет колоний

Применяют требования и рекомендации, установленные в 10.3.1 и 10.3.2.1.1.

В соответствии с периодом термостатирования, установленном в конкретном стандарте, подсчитывают колонии (общие колонии, типичные колонии или предполагаемые подозрительные колонии) в каждой чашке, содержащей до 300 колоний включительно (или любое другое число, установленное в конкретном стандарте).

В данном подразделе рассматриваемые случаи соответствуют следующим общим случаям:

- посев на одной чашке Петри диаметром 90 мм для разведения; проводят как минимум два последовательных разведения;

- максимальное подсчитываемое число общих присутствующих колоний: 300 на чашку;

- максимальное общее число колоний (типичных и нетипичных), присутствующих в чашке в момент подсчета типичных и предполагаемых колоний: предпочтительно 300 на чашку;

- максимальное подсчитываемое число типичных или предполагаемых колоний: 150 на чашку;

- число предполагаемых колоний, инокулированных для идентификации или подтверждения (см. D.4) в каждой отобранной чашке: как правило, пять.

Эти цифры должны быть установлены в конкретных стандартах.

Ниже установленные методы подсчета предназначены для тех случаев, которые встречаются чаще всего в период проведения испытаний в соответствии с надлежащей лабораторной практикой. Иногда могут иметь место особые случаи (например, количество колоний в двух чашках Петри с одним и тем разведением могут демонстрировать существенное расхождение или отношение коэффициентов разбавления, используемых для двух последовательных разведений, может существенно различаться) и поэтому необходимо, чтобы при подсчете результатов опытный микробиолог провел исследование и интерпретацию и, при необходимости, забраковал их.

D.3 Метод расчета: общий случай (подсчет общего числа колоний или типичных колоний)

В целях достижения достоверного результата, как правило, является необходимым проводить подсчет колоний, по меньшей мере, на одной чашке, содержащей минимум 10 колоний [общих колоний, типичных колоний или колоний, соответствующих критериям идентификации или подтверждения (см. D.4)].

Если используют две чашки Петри на одно разведение, соотношение числа колоний, подсчитанных на первой чашке, и колоний, подсчитанных на второй чашке, должно быть равно 1.

Рекомендуется, чтобы для колоний, подсчитываемых на второй чашке, были установлены пределы в лаборатории.

Данные пределы могут являться пределами, установленными в [42].

В случае, когда данные пределы не соблюдаются, результат следует интерпретировать с осторожностью.

Пример 1 - Если подсчет колоний на первой чашке дал максимальное значение 250, то подсчет колоний на второй чашке должен дать минимальное значение 196 (см. [42]).

Рекомендации, касающиеся соотношения подсчетов колоний разведений d₁ и d₂ применимы (см. 10.3.2.2).

Рассчитывают число N микроорганизмов, присутствующих в анализируемой пробе как средневзвешенное двух последовательных разведений, по формуле D.1:

 

(D.1)

 

где - сумма колоний, подсчитанных на всех чашках, отобранных для двух последовательных разведений, при условии, что, по меньшей мере, одна чашка содержит минимум 10 колоний;

V - объем инокулята, использованного в каждой чашке, см³;

n₁ - число чашек, отобранных для первого разведения;

n₂ - число чашек, отобранных для второго разведения;

d - коэффициент разбавления, соответствующий первому отобранному разведению [d = 1, если используют неразбавленный жидкий продукт (анализируемую пробу)].

Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. Если третья цифра меньше пяти, предшествующую цифру не изменяют, если третья цифра больше или равна пяти, увеличивают предшествующую цифру на единицу.

Результат выражают предпочтительно как число от 1,0 до 9,9, умноженное на 10 в соответствующей степени, или целым числом, состоящим из двух значащих цифр.

Результат выражают следующим образом:

- число N микроорганизмов на кубический сантиметр (для жидких продуктов) или на грамм (для прочих продуктов).

Пример 2 - Подсчет дал следующие результаты:

- В первом выбранном разведении (10^-2): 168 и 215 колоний;

- Во втором выбранном разведении (10^-3): 14 и 25 колоний.

 

 

Выполнив округление результатов в соответствии с вышеописанным, получаем число микроорганизмов, равное 19 000 или 1,9·10⁴ на кубический сантиметр или на грамм продукта.

D.4 Метод расчета: случай, когда проведена идентификация или подтверждение

Если используемый метод требует идентификации, определенное количество A предполагаемых колоний (обычно пять) пересеивают с каждой чашки, отобранной для подсчета колоний. После идентификации рассчитывают для каждой чашки число a колоний, соответствующих критерию идентификации, по формуле

 

(D.2)

 

где b - число колоний, соответствующих критериям идентификации, среди идентифицированных колоний A;

C - общее число предполагаемых колоний, подсчитанных в чашке.

Результат вычисления округляют до целого числа. Для этого, если первая цифра после запятой меньше пяти, предшествующую цифру не изменяют, если первая цифра после запятой больше или равна пяти, предшествующую цифру увеличивают на единицу.

Количество N, N_Е, N' идентифицированных или подтвержденных микроорганизмов, присутствующих в анализируемой пробе, рассчитывают путем подстановки вместо значения в формуле, приведенной в D.3, D.5.1 и D.7.3, соответственно.

Результаты округляют, как описано в D.3.

Результаты выражают, как описано в D.3, D.5.1 и D.7.3 соответственно.

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом отобранном разведении (10^-3): 66 и 80 колоний;

- во втором отобранном разведении (10^-4): 4 и 7 колоний.

Тестирование отобранных колоний было выполнено следующим образом:

- из чашки с 66 колониями для идентификации было отобрано восемь колоний, из которых шесть колоний соответствовали критериям, следовательно, a = 50;

- из чашки с 80 колониями для идентификации было отобрано девять колоний, из которых шесть колоний соответствовали критериям, следовательно, a = 53;

- из чашки с 7 колониями для идентификации было отобрано пять колоний, из которых четыре колонии соответствовали критериям, следовательно, a = 6;

- из чашки с 4 колониями для идентификации было отобрано четыре колонии, все из которых соответствовали критериям, следовательно, a = 4.

 

 

Округление результата выполняют в соответствии с D.3, количество микроорганизмов в пробе составило 51000 или 5,1·10⁴ на кубический сантиметр или на грамм продукта.

D.5 Метод расчета: примерные количества

D.5.1 Случай двух чашек (с анализируемой пробой, начальной суспензией или первым разведением), содержащих менее 10 колоний

Требования и рекомендации, описанные в 10.3.2.4.1, касающиеся нижнего предела определения, применимы.

Если каждая из двух чашек с анализируемой пробой (жидкие продукты), с исходной суспензией (прочие продукты) или с первым разведением, засеянными или отобранными, содержит менее 10 колоний (общих колоний, типичных колоний или колоний, соответствующих критериям идентификации или подтверждения), и серия из двух чашек содержит по меньшей мере четыре колонии, рассчитывают примерное количество N_Е микроорганизмов, присутствующих в анализируемой пробе, как среднеарифметическое числа колоний, подсчитанных на двух чашках, по формуле

 

(D.3)

 

где - сумма колоний, подсчитанных на двух чашках;

V - объем инокулята, использованного в каждой чашке, см³;

n - число отобранных чашек (в данном случае, n = 2);

d - коэффициент разбавления исходной суспензии или первого отобранного разведения, посеянного или отобранного [d = 1, если используют неразбавленный жидкий продукт (анализируемую пробу)].

Результат округляют в соответствии с D.3.

Результат выражают следующим образом:

- примерное число N_Е микроорганизмов на кубический сантиметр (для жидких продуктов) или на грамм (для прочих продуктов).

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2): было подсчитано 8 и 9 колоний

 

 

Выполнив округление результатов в соответствии с D.3, получаем примерное число N_Е микроорганизмов, равное 850 или 8,5·10² на кубический сантиметр или на грамм продукта.

D.5.2 Случай двух чашек (с анализируемой пробой, начальной суспензией или первым разведением), не содержащих колоний

В случае, если две чашки с анализируемой пробой (жидкие продукты), исходной суспензией (прочие продукты) или с первым разведением, засеянными или отобранными, не содержат никаких колоний, результат выражают следующим образом:

"менее 1/Vd микроорганизмов на кубический сантиметр (для жидких продуктов) или на грамм (для прочих продуктов)",

где V - объем инокулята, использованного в каждой чашке, см³;

d - коэффициент разбавления исходной суспензии или первого разведения, посеянных или отобранных, [d = 1, если используют неразбавленный жидкий продукт (анализируемую пробу), d = 0,1, когда используют разведение 10^-1 и т.д.].

D.6 Особые случаи (подсчет типичных или предполагаемых колоний)

D.6.1 Если количество всех типичных и атипичных колоний в двух чашках с первым разведением d₁ превышает 300 (или какое-либо другое число, установленное в соответствующем стандарте), среди которых наблюдаются типичные или подтвержденные (идентифицированные) колонии, и если в двух чашках, содержащих последующее разведение d₂, выявлено не более 300 колоний (или какого-либо другого числа, установленного в соответствующем стандарте) и не выявлено типичных или подтвержденных (идентифицированных) колоний, результат выражают следующим образом:

"менее 1/V₂d₂ и более 1/V₁d₁ микроорганизмов на кубический сантиметр (для жидких продуктов) или на грамм (для прочих продуктов)",

где V₁, V₂ - объемы инокулята, используемые в каждой чашке при каждом разведении d₁ и d₂, см³;

d₁, d₂ - коэффициенты разбавления.

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено более 300 колоний на каждой из двух чашек, среди которых присутствуют типичные или подтвержденные колонии;

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 33 и 35 колоний, среди которых нет типичных или подтвержденных колоний.

Результат в пересчете на микроорганизмы будет меньше 1000 и больше 100 на кубический сантиметр или на грамм продукта.

D.6.2 Если количество всех типичных и атипичных колоний в двух чашках с первым разведением d₁ превышает 300 (или какое-либо другое число, установленное в соответствующем стандарте), среди которых не наблюдается типичных или подтвержденных (идентифицированных) колоний, и если в двух чашках, содержащих последующее разведение d₂, выявлено не более 300 колоний (или какого-либо другого числа, установленного в соответствующем стандарте) и не выявлено типичных или подтвержденных (идентифицированных) колоний, результат выражают следующим образом:

"менее 1/V₂d₂ микроорганизмов на кубический сантиметр (для жидких продуктов) или на грамм (для прочих продуктов)",

где V₂ - объем инокулята, используемый в каждой чашке при каждом разведении d₂, см³;

d₂ - коэффициент разбавления.

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено более 300 колоний на каждой из двух чашек, среди которых нет типичных или подтвержденных колоний;

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 33 и 35 колоний, среди которых нет типичных или подтвержденных колоний.

Результат в пересчете на микроорганизмы будет меньше 1000 на кубический сантиметр или на грамм продукта.

D.7 Метод расчета: особые случаи

Применимы требования и рекомендации, изложенные в 10.3.2.5.

D.7.1 Если количество подсчитанных колоний (общих колоний, типичных колоний или предполагаемых подозрительных колоний) превышает максимальное подсчитываемое число (300 или какое-либо другое число, установленное в соответствующем стандарте) для двух чашек, содержащих первое разведение d₁, с числом колоний (общих колоний, типичных колоний или колоний, соответствующих критериям идентификации или подтверждения) менее 10 (нижний предел подсчета) для двух чашек, содержащих второе разведение d₂, результаты выражают следующим образом:

Примечание - Пункты в данном подразделе приведены в качестве примера.

 

c) если число колоний для двух чашек с первым разведением d₁ попадает в интервал, например, 301 - 324 (максимальное подсчитываемое число плюс 1, верхний предел доверительного интервала для максимального подсчитываемого числа) (приложение B) и подсчет колоний для двух чашек для разведения d₂ дал результат не менее чем нижний предел, установленный в 10.3.2.2, используют метод вычисления для общих случаев (см. D.3);

Пример 1 - Подсчет (в случае, когда максимальное количество, равное 300, было установлено для подсчета колоний) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено 310 и 322 колоний (меньше чем 324, верхнего предела доверительного интервала для 300);

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 8 и 12 колоний. Нижние пределы для подсчета колоний при данном разведении (10^-3) - 18 и 19 колоний, установлены на основе 310 и 322 колоний разведения (10^-2).

Результат, полученный при данном подсчете колоний, неприемлем.

Пример 2 - Подсчет (в случае, когда максимальное количество, равное 150, было установлено для подсчета колоний) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено 151 и 160 колоний (меньше чем 167, верхнего предела доверительного интервала для 150);

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 8 и 9 колоний. Нижние пределы для подсчета колоний при данном разведении (10^-3) - 6 и 7 колоний, установлены на основе 151 и 160 колоний разведения (10^-2).

Используют метод вычисления для общих случаев (D.3), используя отобранные чашки для двух разведений.

d) если число колоний для чашки с первым разведением d₁ превышает верхний предел доверительного интервала для максимального подсчитываемого количества (например, 324) и подсчет колоний для разведения d₂ для двух чашек дал результат не менее чем нижний предел, установленный в 10.3.2.2 и рассчитанный на основе верхнего предела доверительного интервала для максимального подсчитываемого количества, учитывают только результат подсчета для разведения d₂ и далее проводят примерный подсчет (см. D.5.1).

Пример 3 - Подсчет (в случае, когда максимальное количество, равное 300, было установлено для подсчета колоний) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено более 324 колоний в каждой из двух чашек;

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 7 и 9 колоний. Нижний предел для подсчета колоний при данном разведении (10^-3) - 19 колоний, установлен на основе 324 колоний разведения (10^-2).

Результат, полученный при данном подсчете колоний, неприемлем.

Пример 4 - Подсчет (в случае, когда максимальное количество, равное 150, было установлено для подсчета колоний) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено более 167 колоний в двух чашках;

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 8 и 9 колоний. Нижний предел для подсчета колоний при данном разведении (10^-3) - 8 колоний, установлен на основе 167 колоний разведения (10^-2).

Оцененное число колоний записывают на основе колоний, подсчитанных в двух чашках для разведения (10^-3) (D.5.1).

Пример 5 - Подсчет (в случае, когда максимальное количество, равное 150, было установлено для подсчета колоний) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено более 167 колоний в двух чашках;

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 5 и 7 колоний. Нижний предел для подсчета колоний при данном разведении (10^-3) - 8 колоний, установлен на основе 167 колоний разведения (10^-2).

Результат, полученный при данном подсчете колоний, неприемлем.

D.7.2 Если количество подсчитанных колоний (общее количество колоний, количество типичных колоний или количество презумптивных колоний) для каждой из чашек всех посеянных разведений дает значение свыше 300 (или любого другого числа, установленного в соответствующем стандарте), результат формулируют следующим образом:

"Более 300/Vd" (в случае общего числа или числа типичных колоний) или "Более (300/Vd) x (b/A)" (в случае подтвержденных (идентифицированных) колоний), выраженных в количестве микроорганизмов на кубический сантиметр (для жидких продуктов) или на грамм (для прочих продуктов),

где d - коэффициент разбавления последнего посеянного разведения;

V - объем инокулята, используемого в каждой чашке, см³;

b - число колоний, соответствующих критериям идентификации среди посеянных колоний A.

D.7.3 Если можно произвести подсчет только в двух чашках с последним засеянным разведением, и они содержат не более 300 колоний (или любое другое количество, установленное в конкретном стандарте) - общее количество колоний, количество типичных колоний или количество презумптивных колоний - число N' присутствующих микроорганизмов вычисляют как среднеарифметическое числа колоний, посчитанных на двух чашках, по формуле

 

 

где - сумма колоний, подсчитанных на двух чашках, как минимум одна из которых содержит не менее 10 колоний;

V - объем инокулята, использованного в каждой чашке, см³;

n - число отобранных чашек (в данном случае, n = 2);

d - коэффициент разбавления, соответствующий отобранному разведению.

Результат округляют в соответствии с D.3.

За результат принимают число микроорганизмов на кубический сантиметр (для жидких продуктов) или на грамм (для прочих продуктов).

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в последнем засеянном разведении (10^-4) 120 и 130 колоний.

Таким образом,

 

 

Округление результата проводят в соответствии с D.3, число N' микроорганизмов равно 1 300 000 или 1,3·10⁶ на кубический сантиметр или на грамм продукта.