ГОСТ ISO 7218-2015. Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

10.5. Подсчет при использовании жидких сред

10.5.1 Принцип

Пробы для анализа высевают в жидкую среду, предназначенную для поддержки роста конкретного микроорганизма или группы микроорганизмов и часто для подавления размножения прочих микроорганизмов.

Чтобы определить, происходит ли рост искомых микроорганизмов, можно использовать различные критерии, например, визуальное обследование помутнения, выделение газа, изменение цвета, последующее выделение микроорганизмов на селективной агаризованной среде в определенных условиях температуры и атмосферы инкубирования. Состав питательной среды и критерии для выявления различий положительного и отрицательного результата определены в соответствующих стандартах.

Используя подобный подход, каждый образец для анализа может быть описан только качественно, значение, т.е. результат оценивается как положительный или отрицательный. Чтобы установить количество присутствующих микроорганизмов, необходимо исследовать несколько проб для анализа, начальных суспензий и разведений и использовать статистические методы для определения наиболее вероятного числа (НВЧ).

10.5.2 Посев

10.5.2.1 Общие положения

Если используют селективную питательную среду, добавление образца для анализа не должно уменьшать селективных свойств этой среды, тем самым способствуя росту прочих микроорганизмов. В большинстве стандартов информация о совместимости определенных образцов и жидкой среды описана в области их применения. Необходимо с осторожностью подходить к таким образцам, как специи, какао, бульон и т.д., поскольку они могут содержать подавляющие рост микроорганизмов вещества, в связи с чем требуют добавления нейтрализующих веществ, применения более высоких коэффициентов разведения, центрифугирования, фильтрования или иммуномагнитной сепарации для выделения искомых микроорганизмов из образца, даже если это специально не оговорено в соответствующих стандартах. Несовместимость может также быть вызвана биологическим составом образца: сильно загрязненные от окружающей среды пробы, ферментированные продукты или продукты, содержащие пробиотики, очевидно представляют большие проблемы микробиологу-аналитику, чем пробы, которые содержат очень незначительное количество микроорганизмов. Для таких проблемных образцов рекомендуется выполнять эксперименты, используя контрольные микроорганизмы, чтобы подтвердить, что метод действительно подходит для анализа данного образца.

При использовании метода НВЧ при анализе твердых проб, в том числе порошкообразных, для подготовки исходной суспензии отбирают только одну пробу. Для анализа данной исходной суспензии используют аликвоты.

10.5.2.2 Проведение анализа

Если в соответствующих стандартах нет иных указаний, объемы образцов для анализа, равные или меньше 1 см³, обычно добавляют к объему сред обычной концентрации, в 5 - 10 раз превышающему объем пробы для анализа. Пробы для анализа объемом от 1 см³ до 100 см³ обычно добавляют к равным объемам сред двойной концентрации.

Для объемов, превышающих 100 см³, допускается использовать более концентрированные среды. Для особых целей стерильную обезвоженную среду можно растворить в холодном (или предварительно нагретом до 30 °C) образце, подлежащем анализу.

Если нет иных указаний, время, прошедшее с момента приготовления первого разведения пробы и момента засева последней пробирки, многолуночного планшета или флакона, должно составлять менее 30 мин.

10.5.3 Выбор способа посева

Сущность метода наиболее вероятного числа заключается в разбавлении пробы до такой степени, чтобы посевной материал не всегда содержал живые микроорганизмы. По "выходу", т.е. по количеству посевного материала, дающему рост в каждом разведении, будет оцениваться начальная концентрация бактерий в пробе. Чтобы получить оценку в широком диапазоне возможных концентраций, микробиологи используют серийные разведения, инкубируя в термостате по несколько пробирок (или чашек и пр.) каждого разведения. НВЧ микроорганизмов, присутствующих на уровне исходной пробы, и точность оценки можно рассчитать с помощью статистических методов на основе числа положительных и отрицательных пробирок, полученных после инкубации в термостате.

Осуществляют выбор НВЧ из различных существующих конфигураций в соответствии:

- с ожидаемым числом микроорганизмов в анализируемой пробе,

- требованиями регламентов,

- требуемой точностью и

- другими практическими соображениями.

Неопределенность измерения зависит от числа положительных образцов для анализа, наблюдаемых практически одинаковым образом, поскольку неопределенность подсчета колоний зависит от числа колоний в чашке. Неопределенность измерения изменятся как функция корня квадратного из числа использованных пробирок, поскольку точность возрастает вместе с увеличением числа повторных испытаний. Число пробирок необходимо увеличить в четыре раза для того, чтобы неопределенность измерения уменьшилась вдвое. Если используют способы только с небольшим числом дублируемых пробирок, неопределенность измерения высокая.

В зависимости от размера образец для анализа можно засевать в пробирки или флаконы, содержащие требуемое количество жидкой среды. Для образцов небольшого объема можно использовать также многолуночные планшеты.

10.5.3.1 Способ одного разведения

Если ожидаемая концентрация микроорганизмов невелика или ожидается ее умеренное изменение, наиболее подходящим способом посева будет одна серия равных проб для анализа. Там, где ожидаемое соотношение между максимальным и минимальным количеством микроорганизмов менее 25, десять параллельных проб для анализа является наименьшим числом для получения необходимых результатов; для 50 параллельных пробирок соотношение 200 является предельным. В случае, когда фактическая концентрация достигает максимального значения НВЧ, вероятность того, что во всех пробирках будет наблюдаться рост или отсутствие роста, будет слишком высокой. Примеры НВЧ для одного разведения приведены в таблицах C.1 - C.4.

10.5.3.2 Способ нескольких разведений

Если концентрация микроорганизмов в пробе неизвестна или предполагается ее значительное изменение, может потребоваться посев на серии пробирок из нескольких разведений. Высевают достаточное число разведений, чтобы обеспечить исследование как с положительными, так и с отрицательными результатами. Число разведений также зависит от метода вычисления, используемого для оценки значения НВЧ. Если требуется применение таблиц, то используют конфигурации способов, представленные в таблицах. При использовании компьютерных программ число разведений и параллельных пробирок не ограничивается, что очень важно с точки зрения использования новых коммерческих тест-наборов для НВЧ.

10.5.3.3 Симметричный способ посева

В наиболее часто применяемом симметричном способе посева для определения НВЧ используют три или пять параллельных пробирок на разведение. Точность, получаемая при применении этого способа, резко уменьшается по мере уменьшения числа пробирок на разведение. Результаты с использованием трех пробирок являются не более чем показателями порядка значения концентрации. Если требуется более высокая точность, рекомендуется использовать пять или больше параллельных пробирок. Примеры определения НВЧ с использованием трех, пяти и десяти пробирок приведены соответственно в таблицах C.5, C.6 и C.7.

10.5.3.4 Асимметричный способ

В асимметричных способах используют разное количество пробирок в разных разведениях. Применение таких способов пригодно только для оценки количества микроорганизмов в четко заданном диапазоне (см. примеры в ISO 8199).

В случае неосторожности пробирка может быть утеряна или разбита, что приведет к необходимости использовать асимметричный способ. Однако некоторые коммерческие тест-наборы предназначены для асимметричных способов. Для оценки данных, полученных на основе асимметричных способов, рекомендуется использовать надлежащее программное обеспечение (см. 10.5.6.3).

10.5.4 Термостатирование

Засеянные пробирки, колбы и флаконы инкубируют в термостате или в водяной бане. Многолуночные планшеты помещают в термостат.

Выбирают продолжительность и температуру инкубации, получив информацию в соответствующем стандарте на конкретный метод испытания, поскольку эти параметры зависят от типа рассматриваемого микроорганизма или группы микроорганизмов.

Для некоторых микроорганизмов может потребоваться термостатирование в два этапа или этап подтверждения. Для получения дополнительной информации см. соответствующие стандарты, но следует иметь в виду, что в этом случае возникают дополнительные трудности с расчетом величины НВЧ (см. ссылку [52]).

10.5.5 Интерпретация результатов

Критерии дифференциации положительных и отрицательных результатов различны для каждого типа микроорганизма или группы микроорганизмов и определяются в соответствующих стандартах. Используя эти критерии, подсчитывают и записывают число положительных результатов, полученных во всех образцах для анализа, взятых из одной лабораторной пробы.

10.5.6 Определение значений НВЧ

Существует три различных способа определения значения НВЧ: вычисление по математическим формулам, сопоставление с таблицами НВЧ или применение специальных компьютерных программ. При условии, что эти методы основаны на одних и тех же статистических допущениях, все эти варианты в равной степени достоверны. Эти три метода описаны ниже.

10.5.6.1 Математический метод

10.5.6.1.1 Приблизительные формулы для всех случаев

Приблизительные значения НВЧ (M) для любого числа разведений и параллельных пробирок получают путем применения следующей формулы (5):

 

(5)

 

где Z_p - число положительных пробирок;

m_s - общая масса пробы во всех пробирках с отрицательной реакцией, в граммах;

m_t - общая масса пробы во всех пробирках, в граммах.

Пример [53]

Допустим, что при испытании 10 проб, каждая из которых имеет массу 0,1, 0,01 и 0,001 г, и определяют 10, 4 и 2 положительных результата. Тогда для получения только фракционных результатов (т.е. 4 и 2) общее количество положительных результатов равно Z_P = 6. Общая анализируемая масса равна: m_t = 10·0,01 + 10·0,001 = 0,11 г; а общая масса в отрицательных пробирках равна m_s = 6·0,01 + 8·0,001 = 0,068 г.

 

 

Данный результат вполне близок к табличному значению для 10-4-2, когда НВЧ на грамм равно 70.

10.5.6.1.2 "Точное" решение для серии пробирок

Значение НВЧ (M) для простой серии пробирок получают по формуле (6):

 

(6)

 

где m - масса пробы в каждой пробирке серии, в граммах;

ln - натуральный логарифм;

N - количество пробирок в серии;

S - количество пробирок с отрицательной реакцией.

10.5.6.1.3 Показатели прецизионности для анализа одного разведения

Пределы доверительного интервала, при уровне вероятности 95%, оценки НВЧ можно рассчитать приблизительно из полученного НВЧ и стандартного отклонения log₁₀M, используя процедуру, описанную в ссылке [55], как это описано в [53] - см. также [52].

Примечание - В соответствии с [57], разделом 12, символ, используемый для обозначения десятичного логарифма - "lg". Вместе с тем, в настоящем стандарте предпочтительно используется обозначение "log₁₀", которое широко распространено в сфере лабораторий пищевой микробиологии.

 

Стандартную ошибку НВЧ рассчитывают по формуле (7):

 

(7)

 

где M - НВЧ;

m - масса инокулята на пробирку;

G - количество пробирок, показавших рост;

exp - экспоненциальный множитель.

Нормальную аппроксимацию к доверительным пределам рассчитывают по формуле

 

 

Пример - Допустим, что 0,1 г пробы (m) было засеяно в каждую из n = 20 пробирок, и имеется G = 4 положительных результата (таким образом, число негативных результатов - 16). Значение НВЧ (M) на грамм вычисляют следующим образом:

 

 

и стандартную ошибку вычисляют следующим образом:

 

 

Далее, log₁₀M = 0,35 и нормальную аппроксимацию к доверительным пределам вычисляют по формуле .

Нижний предел log₁₀M равен 0,35 - (1,96·0,22) = 0,35 - 0,43 = -0,08.

Верхний предел log₁₀M равен 0,35 + 0,43 = 0,78.

Таким образом, нижний предел M равен antilog₁₀(-0,08) = 0,82, и верхний предел M равен antilog₁₀(0,78) = 6,1.

Тем не менее, нет необходимости проводить данные вычисления вручную, так как данные величины могут быть определены при использовании калькулятора НВЧ (10.5.6.3).

10.5.6.1.4 Показатели прецизионности для анализов симметричных множественных разведений

Десятичный логарифм стандартного отклонения способа вычисления НВЧ симметричного множественного разведения может быть получен из приближенной формулы (8) Кохрана [28]:

 

(8)

 

где s - стандартное отклонение десятичного логарифма НВЧ;

f - коэффициент разбавления, проводимого при переходе от одного разведения к другому (как правило, равен 10);

N - число пробирок на разведение.

Верхний и нижний 95%-ные пределы можно оценить путем умножения и деления примерного значения НВЧ на антилогарифм 2s. Данная операция может привести к завышению верхнего доверительного предела. Более точная оценка может быть получена при использовании калькулятора НВЧ (10.5.6.3).

10.5.6.2 Таблицы НВЧ

10.5.6.2.1 Таблицы для одного разведения

Таблицы C.1 - C.4 дают значения НВЧ и 95%-ные доверительные интервалы на образец для анализа для 10, 15, 20 и 25 параллельных пробирок [при этом предполагается, что каждая пробирка засеяна одинаковым объемом материала (одного) разведения].

Чтобы подсчитать итог на контрольную массу образца (или объем для жидких образцов), умножают НВЧ и предельные значения 95%-ного доверительного интервала на отношение (контрольная масса)/(масса пробы для анализа). Нельзя умножать на логарифмическую стандартную неопределенность. За контрольную массу в микробиологических исследованиях обычно берут 1 г. Масса образца для анализа соответствует количеству образца (в граммах), которое представлено в объеме, использованном для засева пробирок, т.е. 0,1 г в случае использования 1 см³ гомогената с разбавлением 10^-1.

Пример [30] - Двадцать пробирок с бульоном двойной концентрации были засеяны аликвотами по 5 см³ десятикратно разбавленной пробы (0,1 г/см³). После термостатирования 16 пробирок из 20 показали заметный рост. Какова была наиболее вероятная бактериальная плотность (организмов на грамм) в пробе? Таблица B.3 дает значение 1,61 как наиболее вероятное число организмов на пробирку при нижнем пределе 95%-ного доверительного интервала, равном 0,93, и верхнем пределе, равном 2,77.

В каждую пробирку было добавлено 5 см³ пробы для анализа, что соответствует 0,5 г пробы. Следовательно, наиболее вероятное число микроорганизмов в 1 г пробы будет задаваться как

на грамм = 3,22 на грамм со следующими 95%-ными доверительными интервалами:

нижний предел 95%-ного доверительного интервала, с нижним пределом 2,5%:

на грамм = 1,9 на грамм;

верхний предел 95%-ного доверительного интервала, с верхним пределом 97,5%:

на грамм = 5,5 на грамм.

10.5.6.2.2 Таблицы для нескольких разведений: три последовательных разведения

Для симметричных способов общей практикой является использование трех последовательных разведений с тремя (таблица C.5), пятью (таблица C.6) или десятью (таблица C.7) параллельными пробирками в каждом разведении. Записывают число положительных пробирок для каждого набора пробирок, и по таблице НВЧ для использованного способа посева подсчитывают наиболее вероятное число микроорганизмов, присутствующих в контрольном объеме образца.

Эти пересмотренные таблицы также содержат десятичные логарифмы для НВЧ, их стандартные отклонения , нижний и верхний пределы для 95%-ного доверительного интервала совместно с указанием "значения редкости" и "категории редкости". Значение редкости (основанное на научном труде Blodgett [52] - [54]) предоставляет упрощенный подход к оценке вероятности того, что наблюдаемое значение будет получено в процессе испытания.

Некоторые комбинации положительных пробирок встречаются чаще, чем другие. Например, комбинация положительных пробирок 0, 0, 3 встречается гораздо реже комбинации 3, 2, 1. Индекс редкости был рассчитан в качестве соотношения двух значений вероятности

 

 

где - вероятность наблюдаемого результата, для серии разведений x₁, x₂, ..., x_k;

- вероятность того, что результат скорее всего будет равным концентрации оценке концентрации .

Полная процедура расчета функции вероятности приведена в [56].

Индекс редкости представляет собой значение от 0 до 1. Оно равно единице, если результат серийного исследования с использованием разведений представляет собой концентрацию, равную оцененному НВЧ. Если это значение приближается к 0, то результат серии исследований с использованием разведений с большой вероятностью не соответствует концентрации, равной оцененному НВЧ. Используя подход, изложенный в [27], используют три категории редкости:

Категория 1:

Значения НВЧ чаще всего наблюдаются, если его значения редкости оказываются в диапазоне 0,05 - 1,00, 0,05 <= n <= 1,00, т.е. такой результат будет вероятно получен в 95% случаев.

Категория 2:

Значения НВЧ получают редко, только если его значения редкости находятся в диапазоне 0,01 - 0,05, 0,01 <= n <= 0,05, т.е. такой результат будет получен с частотой менее 5%.

Категория 3:

Значения НВЧ получают крайне редко, только если его значения редкости находятся в диапазоне 0 - 0,01, 0 <= n <= 0,01, т.е. такой результат будет получен реже, чем 1 на 100 исследований.

В таблицах приведены только те комбинации результатов, которые относятся только к категориям 1 и 2.

В варианте, где используют более трех разведений, важно использовать все значения измеряемых данных. С научной точки зрения некорректно "отбирать" комбинации значений, предполагая, что эти значения более "корректные", чем другие комбинации. Следует записать результаты всех возможных комбинаций положительных пробирок и вычислительные таблицы (см. 10.5.6.3), используемые для расчета значений НВЧ.

10.5.6.3 Компьютерные программы

Используемые для определения значений НВЧ программы необходимы для идентификации маловероятных комбинаций пробирок, поскольку такие комбинации могут отражать трудности выполнения микробиологических анализов (см. 10.5.6.2.2 с учетом маловероятных комбинаций пробирок и использования таблиц расчета НВЧ). Некоторые компьютерные программы пригодны для расчета значений НВЧ с использованием электронных таблиц программы (см. примечание), однако многие программы не пригодны для оценки в тех случаях, когда в программу были введены маловероятные комбинации пробирок и когда для оценивания доверительных пределов были использованы различные подходы.

Было разработано новое программное обеспечение для использования в (см. примечание), в котором можно обрабатывать до 10 уровней серийных разведений. Программа использовалась для расчета оценок НВЧ, их параметры представлены в пересмотренных таблицах C.5, C.6 и C.7. Настоятельно рекомендуется использовать эти программы применительно к другим, с учетом того, что получены идентичные результаты для любых конкретных комбинаций результатов, рассчитанных для трех разведений, по сравнению с опубликованными таблицами. Подробное описание расчетов приведено в [55], а программу можно бесплатно скачать по ссылке:

http://standards.iso.org/iso/7218.

Если электронные таблицы демонстрируют, что какая-либо комбинация пробирок является маловероятной, то соответствующие значения НВЧ не следует принимать во внимание.

Примечание - является торговым наименованием продукции, поставляемой Microsoft. Данная информация приводится для удобства пользователей настоящего документа и не накладывает обязательств со стороны ISO в отношении указанной продукции. Можно использовать эквивалентную продукцию, если она дает аналогичные результаты.