ГОСТ ISO 7218-2015. Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

10.3. Расчеты и выражение результатов, полученных на плотных средах

10.3.1 Подсчет колоний

После термостатирования, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания, подсчитывают количество колоний (общее число колоний, число типичных колоний или предполагаемых колоний) на каждой чашке, содержащей не более 300 колоний (или другого количества, установленного соответствующим стандартом на конкретный метод испытания).

При подсчете типичных или предполагаемых колоний необходимо представить описание колоний, которое дано в соответствующем стандарте на конкретный метод испытания.

В определенных случаях подсчет колоний может быть затруднен (например, когда присутствуют распространяющие "ползучий рост" микроорганизмы). Такие сливные колонии рассматривают как отдельные колонии. Если менее четверти чашки заполнено таким сливным ростом, колонии подсчитывают на другой части чашки и рассчитывают посредством интерполяции теоретическое число, которое должно соответствовать числу микроорганизмов на всей чашке. Если сливной рост отмечается более чем на одной четверти чашки, то подсчет на такой чашке не проводится. Колонии сливных (распространяющихся) микроорганизмов, выросших в форме цепочек, рассматривают как одну колонию.

Примечание - В определенных случаях желательно создать условия для хранения засеянных чашек при температуре (3 +/- 2) °C для использования при сравнении с термостатированными засеянными чашками при подсчете, чтобы избежать исследования мешающих частиц продукта при исследовании колоний. Для различения частиц продукта от колоний можно также использовать бинокулярное увеличительное стекло.

 

Различные методы расчетов приведены в 10.3.2, приложениях B и D. В них учитываются особые случаи и приводится информация о доверительных интервалах.

В различных методах расчетов необходимо принять во внимание чашки, не содержащие колоний, если такие чашки имеются, поскольку при расчете средневзвешенных величин это является важным.

При использовании спирального дозатора подсчет колоний проводят в соответствии с 10.2.4.3.3.

10.3.2 Обработка результатов

10.3.2.1 Общие положения

10.3.2.1.1 В этом подразделе рассматриваются общие случаи:

- посев проводят на одной чашке Петри диаметром 90 мм для каждого разведения и выполняют, по меньшей мере, два последовательных разведения;

- максимальное количество всех присутствующих колоний на чашке составляет 300;

- максимальное общее число колоний (типичных и атипичных), присутствующих на чашке, при подсчете типичных или презумптивных колоний приблизительно равно 300 на чашку;

- максимальное число типичных или презумптивных колоний равно 150 на чашку;

- число презумптивных колоний, отобранных для идентификации или подтверждения (см. 10.3.2.3), в каждой выбранной чашке обычно равно 5.

Такие цифры определены в соответствующих стандартах на конкретный метод испытания. Для микроорганизмов, дающих рост больших колоний, максимальное количество колоний на чашке установлено в соответствующем стандарте.

Если используются чашки с другим диаметром, отличным от 90 мм, максимальное число колоний должно возрастать или уменьшаться пропорционально площади поверхности чашки (или мембраны).

Примеры

- Для засеянных чашек диаметром 55 мм максимальное подсчитываемое число колоний должно быть 110 (что эквивалентно общему количеству 300 КОЕ на чашке Петри диаметром 90 мм).

- Для чашки диаметром 140 мм максимальное подсчитываемое число колоний должно быть 730 (что эквивалентно общему количеству 300 КОЕ на чашке Петри диаметром 90 мм).

10.3.2.1.2 Методы расчета, приведенные ниже, применяются для тех случаев, которые встречаются наиболее часто, когда исследования проводят в соответствии с установившейся лабораторной практикой. Могут встречаться особые случаи (например, отношение коэффициентов разведения, использованное для двух последующих разведений, может значительно отличаться), и именно поэтому необходимо, чтобы полученные результаты подсчета изучал и трактовал квалифицированный микробиолог и, при необходимости, не учитывал недостоверные результаты.

10.3.2.2 Метод расчета: общий случай (подсчет общего количества колоний или типичных колоний)

Для получения достоверного результата при подсчете колоний обычно считается необходимым, чтобы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 10 колоний [общее число колоний, типичных колоний или колоний, соответствующих критериям идентификации (см. 10.3.2.3)].

Рассчитывают число N микроорганизмов, присутствующих в пробе, как средневзвешенное значение из двух подсчетов в последовательных разведениях по формуле

 

(1)

 

где - сумма колоний, подсчитанных на двух чашках, выбранных для подсчета из двух последовательных разведений, в которых хотя бы одна чашка содержит не менее 10 колоний;

V - объем посевного материала, внесенного в каждую чашку, см³;

d - коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению [d = 1, если выбран только неразведенный жидкий продукт (исследуемая проба без разбавления)].

Если используют более одного разведения, соотношение между подсчетом колоний разведения d₂ и подсчетом колоний разведения d₁ должно быть 10%. Верхний и нижний пределы должны быть установлены лабораторией для подсчета колоний разведения d₂. Эти пределы могут быть, например, пределами, которые установлены в [42]. В случае, когда данные пределы не учитываются, результаты следует интерпретировать с осторожностью.

Пример - Если подсчет колоний разведения d₁ дал результат 250, подсчет колоний разведения d₂ должен показать результат не менее 13 (5,2%) и не более 39 (15,6%). См. [42].

Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. Если третья цифра меньше пяти, предшествующую цифру не изменяют, если третья цифра больше или равна пяти, увеличивают предшествующую цифру на единицу.

Результат выражают предпочтительно как число от 1,0 до 9,9, умноженное на 10 в соответствующей степени, или целым числом, состоящим из двух значащих цифр.

За результат принимают количество N микроорганизмов на кубический сантиметр (жидких продуктов) или на грамм (прочих продуктов).

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- В первом выбранном разведении (10^-2): 168 колоний;

- Во втором выбранном разведении (10^-3): 14 колоний.

 

 

Выполнив округление результатов в соответствии с вышеописанным, получаем число микроорганизмов, равное 17000 или 1,7·10⁴ на кубический сантиметр или на грамм продукта.

10.3.2.3 Метод вычисления: после проведения идентификации

Если используемый метод требует идентификации, определенное количество A предполагаемых колоний (обычно пять) пересеивают с каждой чашки, отобранной для подсчета колоний. После идентификации рассчитывают для каждой чашки число a колоний, соответствующих критерию идентификации по формуле

 

(2)

 

где b - число колоний, соответствующих критериям идентификации, среди идентифицированных колоний A;

C - общее число предполагаемых колоний, подсчитанных в чашке.

Результат вычисления округляют до целого числа. Для этого, если первая цифра после запятой меньше пяти, предшествующую цифру не изменяют, если первая цифра после запятой больше или равна пяти, предшествующую цифру увеличивают на единицу.

Количество N, N_Е, N' идентифицированных или подтвержденных микроорганизмов, присутствующих в исследуемой пробе, рассчитывают путем подстановки вместо значения в формуле, приведенной в 10.3.2.2, или путем подстановки a вместо C в формуле, приведенной в 10.3.2.4.1 и 10.3.2.5.3. Результаты округляют, как описано в 10.3.2.2.

Результаты выражают, как описано в 10.3.2.2, 10.3.2.4.1 и 10.3.2.5.3, соответственно.

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом разведении (10^-3): 66 колоний;

- во втором разведении (10^-4): 4 колонии.

Тестирование отобранных колоний было выполнено следующим образом:

- из чашки с 66 колониями для идентификации было отобрано восемь колоний, из которых шесть колоний соответствовали критериям, следовательно, a = 50;

- из чашки с четырьмя колониями все четыре соответствовали критериям, следовательно, a = 4.

 

 

Округление результата выполняют в соответствии с 10.3.2.2, количество микроорганизмов в пробе составило 49000 или 4,9 x 10⁴ на кубический сантиметр или на грамм продукта.

10.3.2.4 Метод вычисления: малые количества

10.3.2.4.1 Одна чашка (анализируемой пробы или исходной суспензии или первого разведения) содержит менее десяти колоний.

Число микроорганизмов от десяти до значения верхнего предела каждого метода находится в диапазоне оптимальной точности. Однако точность быстро уменьшается по мере уменьшения числа колоний менее десяти. Тем не менее, в зависимости от цели исследования нижний предел можно определить в соответствии с представленным ниже для количеств менее десяти.

Согласно [40] определение предела обнаружения будет таким: "Наименьшая средняя концентрация частиц x в образце для исследования (навеске), если ожидаемая относительная стандартная неопределенность равна установленному значению (RSD)". Термин "коэффициент вариации" в настоящее время более предпочтителен, чем RSD. Коэффициент вариации, C_v вычисляют путем деления стандартного отклонения s для популяции образца на среднее для этого образца. Таким образом, .

В случае распределения Пуассона x вычисляют по формуле

 

(3)

 

Если C_v установлено при 50% как предел приемлемой относительной точности (которая считается разумной в микробиологии), нижний предел определения будет при числе колоний, вычисляемых по формуле:

 

 

Таким образом, результаты, основанные на количестве меньше четырех, следует оценивать как простое выявление присутствия искомого микроорганизма.

Вывод: Если в чашке содержится менее десяти колоний, но не менее четырех, результат вычисляют по формуле

 

 

и принимают за результат вычисленное количество N_E микроорганизмов на кубический сантиметр (для жидких продуктов) или на грамм продукта (для прочих продуктов).

Примечание - Термин "оцениваемое количество" означает менее точную оценку истинного значения.

 

Если общее число составит от одного до трех, точность результата будет слишком низкой, и результат необходимо сообщать следующим образом:

"Микроорганизмы присутствуют в количестве менее чем 4/Vd на грамм или кубический сантиметр".

10.3.2.4.2 Чашка (анализируемый образец или исходная суспензия, или первое разведение) не содержит колоний

Если чашка с анализируемой пробой (для жидких продуктов) или исходной суспензией (для прочих продуктов) или отобранная из чашек, засеянных материалом первого разведения, не содержит колоний, результат сообщают следующим образом:

"менее 1/Vd микроорганизмов на кубический сантиметр" (для жидких продуктов) или "менее 1/Vd микроорганизмов на грамм" (для прочих продуктов),

где d - коэффициент разбавления исходной суспензии или первого засеянного или отобранного разведения (d = 10⁰ = 1, если отбирается непосредственно посеянная анализируемая проба жидкого продукта);

V - объем инокулята, используемого в каждой чашке, в кубических сантиметрах.

10.3.2.4.3 Особые случаи

10.3.2.4.3.1 Общие положения

Эти случаи касаются подсчета типичных и предполагаемых колоний.

10.3.2.4.3.2 Случай 1

Если число типичных и атипичных колоний для чашки с первым разведением d₁ превышает 300 (или какое-либо другое число, установленное в соответствующем стандарте на конкретный метод испытания) с выявленными типичными колониями или подтвержденными колониями, и если чашка, содержащая последующее разведение d₂ содержит не более 300 колоний (или не более любого другого числа, оговоренного в соответствующем стандарте), и не наблюдается типичных или подтвержденных колоний, результат сообщают следующим образом:

"Менее 1/V₂d₂ и более 1/V₁d₁ микроорганизмов на кубический сантиметр" (для жидких продуктов) или

"менее 1/V₂d₂ и более 1/V₁d₁ микроорганизмов на г" (для прочих продуктов),

где d₁ и d₂ - коэффициенты разбавления, соответствующие разведениям d₁ и d₂;

V₁ - объем инокулята, используемый в чашке при первом разведении d₁, в кубических сантиметрах;

V₂ - объем инокулята, используемый в чашке при последующем разведении d₂, в кубических сантиметрах.

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено более 300 колоний на чашку, среди которых присутствуют типичные или подтвержденные колонии;

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 33 колонии, среди которых присутствуют типичные или подтвержденные колонии.

Результат в пересчете на микроорганизмы будет от 100 до 1000 на кубический сантиметр или на грамм продукта.

10.3.2.4.3.3 Случай 2

Если количество типичных и атипичных колоний в чашке с первым разведением d₁ превышает 300 (или какое-либо другое число, установленное в соответствующем стандарте), среди которых типичных или подтвержденных (идентифицированных) колоний не наблюдается, и если в чашке, содержащей последующее разведение d₂, выявлено не более 300 колоний (или какого-либо другого числа, установленного в соответствующем стандарте) и не выявлено типичных или подтвержденных (идентифицированных) колоний, результат сообщают следующим образом:

"менее 1/V₂d₂ микроорганизмов на кубический сантиметр" (для жидких продуктов) или "менее 1/V₂d₂ микроорганизмов на г" (для прочих продуктов),

где d₂ - коэффициент разбавления, соответствующий разведению d₂;

V₂ - объем инокулята, используемый в чашке при последующем разведении d₂, в кубических сантиметрах.

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено более 300 колоний на чашку, среди которых нет типичных или подтвержденных колоний;

- во втором выбранном разведении (10^-3) 33 колонии, среди которых нет типичных или подтвержденных колоний.

Результат в пересчете на микроорганизмы будет меньше 1000 на кубический сантиметр или на грамм продукта.

10.3.2.5 Метод вычисления: особые случаи

Примечания

1 Некоторые примеры могут не соответствовать правилам, приведенным в 10.3.2.2, которые устанавливают верхний и нижний пределы подсчета колоний разведения d₂ по сравнению с результатами для разведения d₁. В случае, если проведение повторного исследования невозможно или является неподходящим, результаты можно рассчитать и выразить в соответствии с 10.3.2.2, однако точность будет ниже, чем в случае обычной ситуации; это должно быть отражено в протоколе испытаний.

2 Все объяснения и примеры приведены для случая, когда используют одну чашку Петри на разведение. Случай, когда используют две чашки Петри на разведение, описан в приложении D.

3 Нижние пределы подсчета колоний для разведения d₂, приведенные в примерах, установлены в [42].

4 Значения для доверительного интервала должны быть адаптированы для максимального числа, установленного для подсчета колоний.

 

10.3.2.5.1 Если число подсчитанных колоний (общее число колоний, число типичных колоний или число предполагаемых колоний) выше максимального подсчитываемого числа (равного 300 или какого-либо другого числа, установленного в соответствующем стандарте) для чашки с первым разведением d₁, а число колоний (общее, типичных колоний или колоний, соответствующих критериям идентификации) для чашки со вторым последующим разведением d₂ менее 10 (нижний предел подсчета), то результат выражают следующим образом:

Примечание - Данные пункты настоящего подраздела приведены в качестве примеров.

 

a) если число колоний для чашки с первым разведением d₁ попадает в интервал 301 - 334 (максимальное подсчитываемое число плюс 1, верхний предел доверительного интервала для максимального подсчитываемого числа) (приложение B) и подсчет колоний для разведения d₂ дал результат не менее чем нижний предел, установленный в 10.3.2.2, используют метод вычисления для общих случаев (см. 10.3.2.2).

Пример 1 - Подсчет (в случае, когда максимальное количество, равное 300, было установлено для подсчета колоний) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено 310 колоний (меньше чем 334, верхнего предела доверительного интервала для 300);

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 8 колоний. Нижний предел для подсчета колоний при данном разведении (10^-3) - 18 колоний, установлен на основе 310 колоний разведения (10^-2).

Результат, полученный при данном подсчете колоний, неприемлем.

Пример 2 - Подсчет (в случае, когда максимальное количество, равное 150, было установлено для подсчета колоний) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено 160 колоний (меньше чем 174, верхнего предела доверительного интервала для 150);

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 8 колоний. Нижний предел для подсчета колоний при данном разведении (10^-3) - 7 колоний, установлен на основе 160 колоний разведения (10^-2).

Используют метод вычисления для общих случаев (10.3.2.2), используя отобранные чашки для двух разведений;

b) если число колоний для чашки с первым разведением d₁ превышает верхний предел доверительного интервала для максимального подсчитываемого количества (например, 334) и подсчет колоний для разведения d₂ дал результат не менее чем нижний предел, установленный в 10.3.2.2 и рассчитанный на основе верхнего предела доверительного интервала для максимального подсчитываемого количества, учитывают только результат подсчета для разведения d₂ и проводят примерный подсчет (см. 10.3.2.4.1).

Пример 1 - Подсчет (в случае, когда максимальное количество, равное 300, было установлено для подсчета колоний) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено более 334 колоний в чашке;

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 9 колоний. Нижний предел для подсчета колоний при данном разведении (10^-3) - 20 колоний, установлен на основе 334 колоний разведения (10^-2).

Результат, полученный при данном подсчете колоний, неприемлем.

Пример 2 - Подсчет (в случае, когда максимальное количество, равное 150, было установлено для подсчета колоний) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено более 174 колоний в чашке;

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 9 колоний. Нижний предел для подсчета колоний при данном разведении (10^-3) - 8 колоний, установлен на основе 174 колоний разведения (10^-2).

Оцененное число колоний записывают на основе колоний, подсчитанных на чашке для разведения (10^-3) (см. 10.3.2.4.1).

Пример 3 - Подсчет (в случае, когда максимальное количество, равное 150, было установлено для подсчета колоний) дал следующие результаты:

- в первом выбранном разведении (10^-2) выявлено более 174 колоний в чашке;

- во втором выбранном разведении (10^-3) выявлено 5 колоний. Нижний предел для подсчета колоний при данном разведении (10^-3) - 8 колоний, установлен на основе 174 колоний разведения (10^-2).

Результат, полученный при данном подсчете колоний, неприемлем.

10.3.2.5.2 Если количество подсчитанных колоний (общее количество колоний, количество типичных колоний или количество презумптивных колоний) для каждой из чашек всех посеянных разведений дает значение свыше 300 (или любого другого числа, установленного в соответствующем стандарте), результат формулируют следующим образом:

"Более 300/Vd" (в случае общего числа или числа типичных колоний) или "Более (300/Vd)·(b/A) (в случае подтвержденных (идентифицированных) колоний), выраженных в количестве микроорганизмов на кубический сантиметр (для жидких продуктов) или на грамм (для прочих продуктов),

где d - коэффициент разбавления последнего посеянного разведения;

V - объем инокулята, используемого в каждой чашке, в кубических сантиметрах;

b - число колоний, соответствующих критериям идентификации среди презумптивных колоний A.

10.3.2.5.3 Если чашка с последним засеянным разведением содержит от 10 до 300 колоний (или любое другое количество, установленное в конкретном стандарте) - общее количество колоний, количество типичных колоний или количество презумптивных колоний - число N' присутствующих микроорганизмов вычисляют по формуле

 

(4)

 

где c - число колоний, подсчитанных в чашке;

V - объем посевного материала, использованный для каждой чашки, в кубических сантиметрах;

d - выбранное разведение (коэффициент разбавления).

Результат округляют в соответствии с 10.3.2.2.

За результат принимают число N' микроорганизмов на кубический сантиметр (для жидких продуктов) или на грамм (для прочих продуктов).

Пример - Подсчет дал следующие результаты:

- в последнем засеянном разведении (10^-4) 120 колоний.

Таким образом,

 

 

Округление результата проводят в соответствии с 10.3.2.2, число N' микроорганизмов равно 1 200 000 или 1,2 x 10⁶ на кубический сантиметр или на г.

10.3.2.6 Измерение неопределенности

См. ISO 19036 в отношении количественных определений.