ГОСТ ISO 7218-2015. Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

10.2. Подсчет при использовании плотных питательных сред

10.2.1 Общие положения

Чашка Петри должна быть маркирована этикеткой, на которой указывают номер пробы, разведение, дату посева и другую необходимую информацию.

Необходимо выбрать определенные разведения, чтобы обеспечить получение определенного количества колоний на чашках (см. 10.3.1) и исключить возможные ингибирующие свойства.

Для переноса каждого разведения используют отдельную стерильную пипетку, кроме случаев, когда работу ведут от самого высокого разведения к самым низким разведениям.

Примечание - Данный подпункт приводится для общего случая разведения 10^-1, но также допустимы другие виды разведения (например, 1:5 или 1:2).

 

10.2.2 Количество чашек Петри на каждое разведение

В процедуре подсчета в микробиологии пищевых продуктов обычно используют одну чашку на каждое разведение микроорганизмов с проведением не менее двух последовательных разведений. С целью повышения надежности можно также использовать две чашки на одно разведение.

Если используют только одно разведение, то с целью повышения надежности результатов можно использовать две чашки с данным разведением согласно приложению D.

В лабораториях, которые не применяют принципы обеспечения качества, с целью повышения надежности результатов можно использовать две чашки с одним разведением согласно приложению D.

10.2.3 Методы разливки чашек

Отбирают определенные объемы разведений для исследования, касаясь наконечником пипетки боковой стенки пробирки, чтобы удалить избыточную жидкость с внешней стороны пипетки. Приподнимают крышку стерильной чашки Петри так, чтобы была возможность внесения содержимого пипетки в чашку, после чего содержимое распределяют.

После переноса расплавленной агаровой среды из водяной бани, отирают сухой флакон чистым полотенцем во избежание загрязнения чашек водой. Избегают циркуляции среды на внешней стороне контейнера или на внутренней стороне чашки в процессе ее наполнения. С целью исключить загрязнения среды флакон держат практически горизонтально. Также следует избегать опускание флакона в период между наполнениями. Выливают агаровую среду при температуре 44 °C - 47 °C в каждую чашку Петри (как правило, 18 - 20 см³ агара в чашку Петри диаметром 90 мм, или 45 - 50 см³ агара в чашку Петри диаметром 140 мм для того, чтобы слой среды составлял не менее 3 мм) в течение 15 мин инокуляции (чтобы исключить агрегирование колоний). Необходимо наливать расплавленную среду таким образом, чтобы избежать ее попадания непосредственно в инокулят (посевной материал). Расплавленную среду и инокулят немедленно тщательно перемешивают для получения равномерного распределения микроорганизмов в питательной среде, например, посредством плавных движений чашки взад-вперед, из стороны в сторону и круговых движений. Далее чашки помещают на холодную горизонтальную поверхность, чтобы дать время охладиться и затвердеть питательной среде (время затвердевания агара не должно превышать 10 мин).

Если в исследуемом продукте предполагается присутствие колоний (например, вида Proteus) с "ползучим" ростом, используют для исследования слой со стерильным "голодным" агаром или идентичной питательной средой, наносимые на затвердевший агар в чашки с посеянным материалом (как правило, 5 см³ агара в чашке Петри на 90 см³), чтобы предотвратить или свести к минимуму распространение такого "ползучего" роста.

10.2.4 Поверхностный посев

10.2.4.1 Общие положения

Методы посева, предназначенные для получения только поверхностных колоний на агаровых чашках, имеют некоторые преимущества по сравнению с методом заливки в чашки для выращивания микроорганизмов внутри агара. Морфологию поверхностных колоний легко наблюдать, используя способности оператора различать различные виды колоний. Микроорганизмы не подвергаются действию высокой температуры расплавленной агаровой среды, поэтому количество колоний может быть выше.

Используют предварительно заполненные агаровой средой чашки, толщина агарового слоя которых составляет не менее 3 мм. Слой агара должен быть ровным и не содержать пузырьков воздуха и поверхностной влаги.

Чтобы облегчить равномерное распределение, поверхность затвердевшего агара необходимо подсушить в соответствии с ISO 11133 или в соответствии с другим соответствующим стандартом. В таком случае посевной материал абсорбируют в течение 15 мин.

10.2.4.2 Метод посева с помощью шпателя

С помощью стерильной пипетки инокулят жидкой пробы или исходной суспензии в случае других проб (обычно от 0,1 до 0,5 см³) переносят на агаровую среду в чашки Петри (диаметром 90 или 140 мм, соответственно). Данную процедуру повторяют для следующего десятичного разведения (колонии, подлежащие подсчету, тогда будут представлены в степени разбавления 10^-2 в случае материала жидкой пробы и 10^-2 в случае материала другой пробы) и, при необходимости, повторяют дальнейшие десятичные разведения.

Если необходимо подсчитать незначительное количество микроорганизмов в определенных продуктах, предел обнаружения можно увеличить в десять раз посредством анализа 1,0 см³ пробы в случае жидких продуктов и 1,0 см³ исходной суспензии в случае других продуктов. Для этой цели, 1,0 см³ посевного материала распределяют или по поверхности большой чашки Петри (диаметром 140 мм) или по поверхностям трех обычных чашек Петри (диаметром 90 мм). При использовании только одного разбавления подготавливают дубликаты, используя две большие чашки или шесть малых.

С помощью шпателя, изготовленного из стекла, пластмассы или стали (например, изготовленной из стекла палочки, изогнутой в форме хоккейной клюшки диаметром приблизительно 3,5 мм и длиной 20 см, изгибы выполнены под прямым углом на расстоянии 3 см от одного конца палочки и сплющены на концах с помощью нагревания), распределяют посевной материал, по возможности, быстро и равномерно по поверхности агара, не касаясь боковых стенок чашки Петри. Закрыв чашку крышкой, дают посевному материалу абсорбироваться в течение 15 мин при комнатной температуре.

В определенных случаях (как указано в соответствующем стандарте) посевной материал можно поместить на мембрану и потом распределить по среде, как описано выше.

10.2.4.3 Метод спирального нанесения материала

10.2.4.3.1 Общие положения

Метод спирального нанесения посевного материала для определения уровня содержания микроорганизмов проверен в межлабораторных испытаниях молока и молочных продуктов и других пищевых продуктов.

Используемое оборудование - спиральный дозатор - описан в 5.24.

10.2.4.3.2 Приготовление чашек с агаровой средой

Для приготовления чашек с агаровой средой рекомендуется использовать автоматический дозатор со стерильной системой дозирования, чтобы получить чашки с одинаковым объемом агаровой среды, с целью гарантии, что слои агара ровные, не содержат пузырьков воздуха и стерильные.

Во все чашки наливают одинаковое количество агара таким образом, чтобы под дозирующей иглой спирального дозатора высота слоя агара была одинаковой во всех чашках, и чтобы угол контакта оставался правильным и одинаковым.

Перед использованием чашки высушивают (см. ISO 11133), чтобы на поверхности среды не осталось капель воды.

10.2.4.3.3 Процедура нанесения посевного материала и подсчет

Обеззараживают кончик дозирующей иглы и трубку, обмакнув их в растворе гипохлорита натрия (см. 5.24.4), а затем в стерильную воду через систему, перед тем как втянуть в дозирующую иглу жидкий образец. В качестве альтернативы используют одноразовый микрошприц, если это предусмотрено в оборудовании.

Помещают предварительно разлитую агаровую среду в чашке Петри на поворотный столик и опускают дозирующую иглу. Проба неравномерно распределяется по среде по мере движения кончика иглы по поверхности агаровой среды. Засеянную чашку убирают, а дозирующую иглу возвращают в исходное положение. Иглу обеззараживают или заменяют микрошприц и загружают для посева в другие чашки.

Закрыв чашку крышкой, дают посевному материалу абсорбироваться в течение 15 мин при комнатной температуре, после чего проводят термостатирование (см. 10.2.5).

После термостатирования на поверхность засеянной агаровой среды в центр чашки помещают специальную сетку для подсчета количества микроорганизмов в чашках, засеянных по спирали. Для определения количества микроорганизмов используют "правило двадцати". Подсчет колоний начинают, выбрав клин и начав подсчет от наружного края первого сегмента по направлению к центру, пока не подсчитают 20 колоний. Процедуру завершают подсчетом в сегменте, содержащем двадцатую колонию. На противоположной стороне чашки подсчитывают соответствующий участок и делят число колоний, подсчитанных по обе стороны, на объем образца, нанесенный на два данных участка. Объемы образца, соответствующие каждой части счетной сетки, приведены в инструкциях, которые прилагаются к каждому спиральному дозатору.

10.2.5 Термостатирование

Если в соответствующих стандартах нет специальных оговорок, чашки после посева незамедлительно переворачивают и быстро помещают в термостат с установленной соответствующей температурой. Если происходит интенсивное обезвоживание (например, при 55 °C или в случае интенсивной циркуляции воздуха), чашки перед термостатированием неплотно укладывают в пластиковые пакеты или используют сходную систему равной эффективности.

Во время термостатирования неизбежно происходят незначительные колебания температуры, например, во время типичных операций загрузки и разгрузки термостата, но важно, чтобы такие периоды занимали минимальное время. Продолжительность таких операций рекомендуется отслеживать, чтобы не допустить их заметного влияния на результат.

В определенных обстоятельствах желательно поместить засеянные чашки в холодильник не более чем на 24 ч перед термостатированием. Если это используется, лаборатория должна гарантировать, что подобная практика не влияет на результат подсчета.

Обычно чашки Петри составляют друг на друга, не более шести штук в стопке при аэробной инкубации. Стопки следует ставить друг от друга и от стенок термостата на расстоянии не менее 25 мм. Однако в термостатах, оснащенных системой циркуляции воздуха, высота стопок может быть больше, а расстояние между ними меньше; однако в этом случае необходимо проверять равномерность распределения температуры в термостате.

После термостатирования чашки следует немедленно исследовать. Однако их можно хранить, если нет иных указаний в соответствующих стандартах, до 48 ч в холодильнике. Хранение в холодильнике допускается только в случаях, если показано, что оно не влияет на количество искомых микроорганизмов, внешний вид или последующую идентификацию колоний. Охлажденные чашки с некоторыми средами, содержащими индикаторные красители, рекомендуется привести в равновесие с условиями окружающей среды при комнатной температуре перед исследованием, чтобы обеспечить восстановление правильной окраски.