ГОСТ Р 56145-2014. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые функциональные. Методы микробиологического анализа

5 Подготовка к анализу

 

5.1 Отбор проб и подготовка их к анализу - по ГОСТ 31904, ГОСТ 26669, ГОСТ 26809, ГОСТ Р 53430, ГОСТ Р 54004 с учетом следующих положений.

5.1.1 Отбор проб пробиотических пищевых продуктов для микробиологических анализов проводят перед отбором проб для физико-химических и органолептических анализов.

Анализируют пробы, отобранные из транспортной или потребительской упаковки с продукцией, попавшей в выборку. Объем выборки установлен требованиями ГОСТ Р 53430, ГОСТ 26809, ГОСТ 15113.0, ГОСТ 6687.0, ГОСТ 28495.

При контроле продукции в потребительской упаковке из партии продукции отбирают соответствующее количество единиц потребительской упаковки для приготовления точечных проб по 5.1.3.

Пробу для анализа отбирают по ГОСТ 31904, ГОСТ Р 54004 взвешиванием (для твердых и сухих продуктов) или измерением объема (для жидких продуктов). Отбор проб проводят в стерильную посуду достаточной вместимости и подходящей формы (стеклянные колбы, банки, чашки Петри), закрывают стерильными пробками или крышками, горловины колб и банок закрывают стерильной бумагой и обвязывают. Допускается использовать для отбора проб одноразовые асептические контейнеры с крышками.

5.1.2 Жидкие и сыпучие порошкообразные пробиотические продукты перемешивают до вскрытия упаковки пятикратным переворачиванием. Перед вскрытием поверхность упаковки продукта протирается для удаления грязи, при необходимости обмывается питьевой водой и подсушивается. Затем поверхность упаковки протирается 70%-ным этиловым спиртом. После высыхания поверхности производится вскрытие упаковки в асептических условиях стерильными или профламбированными инструментами. Продукт во вскрытых упаковках вновь тщательно перемешивается.

5.1.3 Из отобранной суммарной пробы готовят лабораторную пробу - определенное количество или определенный объем продукта, достаточное по размеру для приготовления проб для анализа, необходимых для анализа предполагаемого или допускаемого количества посторонних микроорганизмов, указанных в документе на анализируемый продукт (для высева в питательные среды и приготовления разведений).

При этом масса средней пробы для пробиотических продуктов на молочной и молокосодержащей основе твердых, сыпучих и пастообразных должна быть не менее 100 г, для жидких - не менее 100 см³.

Для прочих функциональных продуктов, обогащенных пробиотическими микроорганизмами, - не менее 150 г (см³), для БАД на основе пробиотических микроорганизмов сухих - не менее 70 г (см³), жидких - не менее 100 см³.

Масса или объем пробы, предназначенной для приготовления первого (исходного) разведения продукта или БАД, должна составлять 10 г или 10 см³ продукта, для посева в питательные среды - соответствовать нормируемой величине для определяемого микроорганизма.

Примечание - Например, при анализе БГКП в сухих БАД на основе пробиотических микроорганизмов размер точечной пробы для посева в питательную среду должен составлять 2 г, БАД жидких на основе чистых культур микроорганизмов неконцентрированных - 10 см³.

 

5.1.4 В случае многокомпонентного состава пробу продукта отбирают так, чтобы в ней были представлены все его компоненты в том же соотношении, что в анализируемой пробе.

5.1.5 Жидкие кисломолочные и сквашенные пробиотические продукты на молокосодержащей основе, жидкие БАД к пище с пробиотическими микроорганизмами и прочие пробиотические ферментированные продукты и ингредиенты, перед проведением анализа нейтрализуют для предотвращения резкого снижения pH (на 0,5 ед. pH и более) питательных сред. Из каждой пробы после тщательного перемешивания стерильной пипеткой или стеклянной палочкой отбирают необходимый объем продукта, помещают в стерильную посуду и затем на каждые 10 см³ анализируемого продукта добавляют около 1,0 см³ стерильного раствора двууглекислого натрия (гидрокарбоната) с массовой концентрацией 100 г/дм³; содержимое перемешивают с использованием стерильных приспособлений или шуттель-аппарата. Добавляют раствор гидрокарбоната, проверяя pH смеси с помощью индикаторной бумаги и доводя активную кислотность до (7,0 +/- 0,2) ед. pH.

Допускается проводить нейтрализацию после внесения продукта или его разведений в питательные среды с помощью стерильного раствора гидроокиси натрия, приготовленного по ГОСТ 10444.1. Добавляют раствор гидроокиси натрия, проверяя pH смеси с помощью индикаторной бумаги и доводя активную кислотность до (7,0 +/- 0,2) ед. pH.

5.1.6 Нейтрализацию сухих кисломолочных и сквашенных пробиотических продуктов на молокосодержащей основе, БАД на основе пробиотических микроорганизмов, высушенных в среде культивирования, в том числе таблетированных и инкапсулированных, ингредиентов сухих, содержащих пробиотические микроорганизмы, например, лиофилизированной биомассы пробиотических микроорганизмов, проводят на этапе приготовления разведений для посева или на этапе посева в среды для предварительного обогащения после внесения в них продукта или его разведений аналогично 5.1.5.

5.1.7 Творог, сыр, продукты творожные и другие аналогичные по консистенции пастообразные пробиотические продукты взвешивают на стерильном часовом стекле, чашке Петри, в бюксе, переносят в стерильную или профламбированную ступку, прикрытую крышкой от чашки Петри, или пакет для перистальтического гомогенизатора, тщательно растирают, нейтрализуют по 5.1.5.

5.1.8 Мороженое, обогащенное пробиотическими микроорганизмами

Пробы мороженого, обогащенного пробиотическими микроорганизмами, помещают в стерильную посуду с притертой или ватной пробкой. Перед использованием посуду с пробой нагревают на водяной бане при температуре не выше 40 - 45 °C и перемешивают до получения однородной эмульсии. При необходимости расплавленную пробу нейтрализуют по 5.1.5.

5.1.9 Микробиологические анализы скоропортящихся пробиотических продуктов проводят не позднее чем через 4 ч с момента отбора проб.

Пробы скоропортящихся пробиотических продуктов следует хранить и транспортировать до начала анализа в условиях, обеспечивающих температуру продуктов не выше (4 +/- 2) °C, не допуская подмораживания.

Пробы замороженных пробиотических продуктов хранят и транспортируют при минусовых температурах в соответствии с условиями хранения конкретного продукта.

Пробы сухих пробиотических продуктов следует хранить и транспортировать до начала анализа в условиях температуры и относительной влажности, в соответствии с условиями хранения конкретного продукта.

 

5.2 Подготовка посуды и материалов

 

Всю новую посуду, предназначенную для бактериологических работ, кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты объемной долей 1% - 2%) в течение 15 мин, затем ополаскивают дистиллированной водой.

Посуда с питательными средами после учета роста на них БГКП, E. coli, Salmonella, S. aureus, дрожжей, плесневых грибов, Listeria обеззараживается перед мойкой путем стерилизации в автоклаве по режимам, установленным для соответствующих групп микроорганизмов в [4].

Вымытую посуду стерилизуют в сушильном шкафу при (160 +/- 5) °C в течение 2 ч или в автоклаве при (121 +/- 1) °C в течение (30 +/- 1) мин с последующим подсушиванием в сушильном шкафу.

Чашки Петри, пипетки и т.п. стерилизуют завернутыми в плотную оберточную бумагу или в пеналах. В верхнюю часть пипетки предварительно вкладывают кусочек ваты.

Пробирки, флаконы, бутылки, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки (кроме пробирок) надевают бумажный колпачок, который обвязывают вокруг горлышка ниткой или закрепляют резиновыми обхватами.

Каучуковые, корковые и стеклянные пробки стерилизуют отдельно в автоклаве завернутыми в бумагу.

Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками. Срок хранения стерильной посуды - не более 30 сут при ненарушенной завертке или невскрытых пеналах.

Допускается использование одноразовой стерильной пластиковой посуды при соблюдении сроков годности, указанных на упаковке.

 

5.3 Приготовление растворов реактивов и питательных сред

 

Для приготовления растворов и питательных сред используют дистиллированную воду или подготовленную питьевую воду.

5.3.1 Стерильная дистиллированная вода

Дистиллированную воду разливают в колбы или пробирки в необходимых количествах и стерилизуют в течение (20 +/- 1) мин при (121 +/- 1) °C.

5.3.2 Приготовление раствора двууглекислого натрия для нейтрализации проб

В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 100 см³ помещают (10,0 +/- 0,1) г двууглекислого натрия, добавляют небольшое количество дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор разливают по 10 - 20 см³ в пробирки и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение (15 +/- 1) мин.

5.3.3 Приготовление раствора соляной кислоты объемной долей 20%

В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 1000 см³ наливают до половины дистиллированную воду, потом осторожно добавляют 20 см³ концентрированной соляной кислоты плотностью 1,19 г/см³ по ГОСТ 3118. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки. При необходимости полученный раствор разводят, доводя до нужной концентрации по объему.

5.3.4 Приготовление изотонического раствора хлористого натрия

В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 1000 см³ помещают (8,5 +/- 0,1) г хлористого натрия. Добавляют дистиллированную воду и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор разливают по 10 см³ в пробирки, по 90 см³ в колбы соответствующей вместимости и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.

5.3.5 Приготовление концентрированного раствора фосфатного буфера

В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 1000 см³ наливают 500 см³ дистиллированной воды, добавляют (34,0 +/- 0,1) г однозамещенного фосфорнокислого калия (KH₂PO₄) и тщательно перемешивают. Устанавливают активную кислотность раствора (7,2 +/- 0,1) ед. pH добавлением раствора гидроокиси натрия и доводят дистиллированной водой до метки.

Стерилизуют раствор при температуре (121 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.

5.3.6 Приготовление разбавленного раствора фосфатного буфера

В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 1000 см³ помещают 1,25 см³ концентрированного раствора фосфатного буфера, добавляют дистиллированную воду и тщательно перемешивают. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор разливают по 10 см³ в пробирки, по 90 см³ в колбы соответствующей вместимости, стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин и используют для приготовления разведений.

5.3.7 Приготовление раствора лимоннокислого натрия

Растворяют (20,0 +/- 0,1) г трехзамещенного лимоннокислого натрия в 1 дм³ дистиллированной воды, разливают в пробирки по 10 см³ или в колбы по 90 см³ и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин. Раствор используют для разведения функциональных продуктов на основе творога, творожных продуктов, сыра.

5.3.8 Приготовление забуференной пептонной воды

Забуференную пептонную воду для предварительного неселективного обогащения бактерий рода Salmonella, коагулазоположительных стафилококков готовят согласно ГОСТ 31659. Разливают в необходимом количестве в пробирки, флаконы или колбы соответствующей вместимости для обеспечения соотношения засеваемого продукта и среды 1:9, например, при посеве 25 г продукта - по 225 см³, 2 г продукта - 18 см³.

5.3.9 Приготовление растворов и реактивов для окраски по Граму осуществляют по ГОСТ 10444.1.

5.3.10 Для удаления закрепленных основных красящих растворов используют этиловый спирт (при окраске спиртовым раствором кристаллического фиолетового) и ацетон (при окраске водным раствором кристаллического фиолетового).

5.3.11 Приготовление питательных сред

Среды сухие промышленного изготовления, в том числе общего назначения, предназначенные для культивирования бактерий с целью изучения их свойств (питательный агар или бульон, триптон-соевый агар или бульон, мясо-пептонный агар или бульон, триптозный ГРМ-агар или бульон) готовят согласно прописям, указанным на этикетках. Допускается применение сред лабораторного приготовления из отдельных компонентов. Проверку качества подготовки, изготовления и оценки эффективности питательных сред для выращивания бактерий осуществляют по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ ISO 11133-1 и ГОСТ ISO 11133-2.

5.3.12 Определение pH питательных сред

Ориентировочное определение pH питательных сред допускается проводить с помощью индикаторных бумажных полосок для определения величины pH. Определение активной кислотности (pH) питательных сред проводят в использованием pH-метра по прилагаемым инструкциям к соответствующим приборам.

Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял требуемую величину при температуре 25 °C. При необходимости корректируют pH питательной среды, устанавливая ее в небольшом объеме путем добавления по каплям растворов гидроокиси натрия или соляной кислоты. Допускается для подкисления сред использовать 20%-ный раствор молочной кислоты.

Исходя из количества раствора, пошедшего на установление pH в данном объеме, вычисляют, какой объем раствора следует прибавить ко всему объему среды для достижения требуемой величины pH. После прибавления раствора и тщательного перемешивания снова проверяют pH среды.

5.3.13 Питательные среды и растворы реактивов для выявления бактерий группы кишечных палочек и Escherichia coli

5.3.13.1 Среда Кесслер (с лактозой)

Жидкую селективную обогатительную среду Кесслер готовят по ГОСТ 31747. Дополнительно в случае использования среды нормальной концентрации для посева образцов пробиотических продуктов на молочной основе, масса (объем) которых превышает 1 г (см³), разливают среду в колбы или флаконы соответствующей вместимости, содержащие пробирки Дархама (поплавки), по 50 см³; в случае использования среды двойной концентрации для посева образцов других пробиотических продуктов, масса (объем) которых превышает 10 г (см³), разливают среду в колбы или флаконы соответствующей вместимости, содержащие пробирки Дархама (поплавки), по 100 см³.

5.3.13.2 Бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью

Жидкую селективную обогатительную среду бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью готовят по ГОСТ 31747. Дополнительно в случае использования среды двойной концентрации для посева образцов, масса (объем) которых превышает 10 г (см³), допускается разливать среду в колбы или флаконы соответствующей вместимости, содержащие пробирки Дархама (поплавки), по 100 см³.

5.3.13.3 Бульон селективный с лаурилсульфатом (натрия додецилсульфатом)

К 1,0 дм³ водопроводной воды добавляют 20 г триптозы (ферментативного перевара казеина и животных белков), 5 г лактозы, по 2,75 г калия гидрофосфата и дигидрофосфата, 5 г хлористого натрия, 0,1 г натрия додецилсульфата (лаурилсульфата), растворяют, нагревая на водяной бане при помешивании 2 - 3 мин. При необходимости фильтруют через ватно-марлевый фильтр, после чего доводят объем водой до 1 дм³. Устанавливают pH (6,8 +/- 0,2) ед. при 25 °C. При необходимости приготовления среды двойной концентрации количество всех ингредиентов, кроме воды, удваивают. Разливают по 10 см³ в пробирки размером 16 x 160 мм, содержащие пробирки Дархама (в случае использования среды нормальной концентрации), или в пробирки размером 20 x 200 мм или колбочки вместимостью 50 см³, содержащие пробирки Дархама (поплавки) (в случае использования среды двойной концентрации).

Стерилизуют среду в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 10 мин. Пробирки Дархама не должны содержать воздушные пузырьки после стерилизации.

5.3.13.4 Сухие среды бульон лактозный с бриллиантовым зеленым и желчью, среду Кесслер, бульон селективный с лаурилсульфатом, EC-бульон промышленного производства подготавливают для посева согласно прописи на этикетке.

5.3.13.5 Среды сухие Левина, Эндо <*>

--------------------------------

<*> Среды могут использоваться также для пересева бактерий рода Salmonella.

 

Среды Левина (эозин-метиленово-голубой агар), Эндо промышленного выпуска готовят согласно прописи, указанной на этикетке банок. Изготовленные и разлитые в стерильные чашки Петри среды можно хранить при температуре (4 +/- 2) °C до 10 сут.

5.3.13.6 Среда на индол (триптон/триптофановая среда) <*>

--------------------------------

<*> Среда может использоваться также для определения образования индола бактериями рода Salmonella.

 

В 1,0 дм³ дистиллированной воды растворяют 10 г ферментативного перевара казеина (триптона), 5 г хлористого натрия, 1 г DL-триптофана. Доводят pH до (7,0 +/- 0,1) ед. при 25 °C, разливают в пробирки по 5,0 см³, стерилизуют в течение (15 +/- 1) мин при температуре (121 +/- 1) °C.

5.3.13.7 Среда Кларка с глюкозой (VP-среда) <**>

--------------------------------

<**> Среда может использоваться также для определения образования ацетоина бактериями рода Salmonella.

 

Взвешивают 7 г пептона, 5 г глюкозы, 5 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Растворяют ингредиенты в 950,0 см³ дистиллированной воды, устанавливают pH (6,9 +/- 0,2) ед. при 25 °C. При необходимости фильтруют и доводят общий объем до 1,0 дм³ дистиллированной водой. Разливают в пробирки по 3,0 - 5,0 см³, стерилизуют в течение (20 +/- 1) мин при (115 +/- 1) °C.

5.3.13.8 90%-ный раствор этилового спирта

В колбу по ГОСТ 1770 емкостью 1000 см³ к 900,0 см³ 96%-ного этилового спирта добавляют 60,0 см³ дистиллированной воды.

5.3.13.9 Раствор индикатора метилового красного

0,1 г индикатора метилового красного помещают в мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 500 см³, растворяют в 300,0 см³ 90%-ного раствора этилового спирта, доливают до 500,0 см³ дистиллированной водой. Хранят раствор в колбе с притертой пробкой при температуре (4 +/- 2) °C.

5.3.13.10 0,5%-ный раствор бромтимолового синего в спирте

Взвешивают 0,5 г бромтимолового синего, помещают в мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 100 см³, и доводят этиловым спиртом до метки. Раствор хранят при температуре (4 +/- 2) °C течение 30 - 35 сут в колбе с притертой пробкой.

5.3.13.11 0,5%-ный и 0,1%-ный растворы бриллиантового зеленого.

Для приготовления 0,5%-ного раствора асептически взвешивают 0,5 г индикатора бриллиантового зеленого, вносят в стерильную мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 100 см³ и доводят стерильной дистиллированной водой до метки. Для приготовления 0,1%-ного раствора в стерильный мерный цилиндр или колбу по ГОСТ 1770 к 10,0 см³ исходного 0,5%-ного раствора индикатора добавляют 40,0 см³ стерильной дистиллированной воды.

Растворы хранят в холодильнике в течение 7 - 10 сут.

5.3.13.12 1,6%-ный раствор бромкрезолового пурпурного в спирте

Взвешивают 1,6 г индикатора бромкрезолового пурпурного и количественно переносят в мерную колбу по ГОСТ 1770, вместимостью 100 см³. Доводят 96%-ным этиловым спиртом до метки. При необходимости фильтруют через бумажный фильтр. Хранят в колбе со шлифом в условиях холодильника.

5.3.13.13 5%-ный спиртовый раствор 1-Нафтола (альфа-нафтола) <***>

--------------------------------

<***> Реактив может использоваться также для определения образования ацетоина бактериями рода Salmonella.

 

Взвешивают 5 г альфа-нафтола, растворяют в 100,0 см³ 96%-ного этилового спирта. Раствор готовят непосредственно перед применением.

5.3.13.14 40%-ный раствор гидроокиси калия

В стакане, вместимостью 100 см³ взвешивают 40 г гидроокиси калия, переносят в мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 100 см³, растворяют в 60,0 см³ дистиллированной воды, затем доводят до метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре 4 - 6 °C.

5.3.13.15 1%-ный водный раствор кристаллического фиолетового

В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 100 см³ помещают 1 г кристаллического фиолетового, предварительно растертого в фарфоровой ступке с небольшим количеством дистиллированной воды, доводят до метки дистиллированной водой. Раствор хранят при температуре 4 - 6 °C.

5.3.13.16 Реактив на индол (Эрлиха) <****>

--------------------------------

<****> Реактив может использоваться также для определения образования индола бактериями рода Salmonella.

 

Взвешивают 5 г пара-диметиламинобензальдегида в стеклянном стакане вместимостью 100 см³, помещают в коническую колбу вместимостью 200 см³ по ГОСТ 25336 и растворяют в 50,0 см³ этилового спирта. С помощью мерного цилиндра, вместимостью 100 см³, медленно добавляют 50,0 см³ концентрированной соляной кислоты (плотность 1,18 - 1,19 г/см³). Раствор хранят в колбе с притертой пробкой при температуре 4 - 6 °C.

5.3.13.17 Среда Козера

Взвешивают 1,5 г фосфорнокислого натрия-аммония, 1 г фосфорнокислого двузамещенного калия, 0,2 г сульфата магния, 3 г лимоннокислого трехзамещенного натрия. Растворяют в 950,0 см³ дистиллированной воды, добавляют 10,0 см³ 0,5%-ного спиртового раствора бромтимолового синего. Устанавливают pH (6,8 +/- 0,1) ед. при 25 °C. Доводят объем дистиллированной водой до 1,0 дм³. Разливают по 10,0 см³ в пробирки, стерилизуют в течение (15 +/- 1) мин при (121 +/- 1) °C.

5.3.13.18 Среда Симмонса

Среду готовят аналогично среде Козера (см. 5.3.13.15), но после измерения pH в нее добавляют 2 г агара на 1000 см³, прогревают на водяной бане до расплавления агара, стерилизуют в течение (15 +/- 1) мин при (121 +/- 1) °C. Разливают в стерильные чашки Петри или пробирки.

5.3.14 Питательные среды, растворы реактивов и диагностические сыворотки для выявления бактерий рода Salmonella

5.3.14.1 Магниевую среду Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) - основную среду для селективного обогащения сальмонелл готовят по ГОСТ 31659.

Среду RVS-бульон сухую промышленного изготовления готовят согласно прописи на этикетке.

5.3.14.2 Селенитовую среду накопления Лейфсона - дополнительную среду для селективного обогащения сальмонелл готовят по ГОСТ 31659.

Дегидратированную селенитовую среду промышленного производства приготавливают согласно прописи на этикетке.

5.3.14.3 Бульон тетратионатный Мюллера-Кауфмана (МКТ-бульон) - дополнительную среду для селективного обогащения сальмонелл готовят по ГОСТ 31659.

5.3.14.4 Дифференциально-диагностические среды для выделения сальмонелл:

- ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-агар) и бриллиантовый зеленый агар готовят по ГОСТ 31659;

- среды Плоскирева и висмут-сульфитный агар промышленного производства готовят согласно прописи, указанной на этикетке банки.

Изготовленные и разлитые в стерильные чашки Петри среды можно хранить и холодильнике до 10 сут.

5.3.14.5 Трехсахарный железистый агар комбинированный с мочевиной (TSI-агар с мочевиной)

TSI-агар с мочевиной готовят смешиванием следующих ингредиентов: дистиллированная вода - 1000,0 см³;

сухой питательный агар - 25 г;

лактоза - 10,0 г;

сахароза - 10,0 г;

глюкоза - 1 г;

мочевина - 10,0 г;

железо сернокислое (FeSO₄·7H₂O) - 0,2 г;

натрий серноватистокислый (Na₂S₂O₃·5H₂O) - 0,3 г;

0,4%-ный водный раствор фенолового красного - 4,0 см³.

Тщательно перемешивают и устанавливают значение активной кислотности (7,3 +/- 0,1) ед. pH. Разливают в пробирки по 5,0 - 7,0 см³ и стерилизуют 15 мин в автоклаве при (121 +/- 1) °C. После стерилизации пробирки со средой оставляют в наклонном положении так, чтобы высота столбика среды была не менее 3 см, а скошенная поверхность над ним - 5 см. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.

5.3.14.6 0,4%-ный водный раствор фенолового красного

Взвешивают 0,1 г индикатора фенолового красного, вносят в колбу вместимостью 50 см³ по ГОСТ 1770 и вливают 25,0 см³ дистиллированной воды. Тщательно перемешивают до полного растворения. Раствор хранят в холодильнике до 7 сут.

5.3.14.7 Среда Клиглера из сухих питательных сред с мочевиной

Среду готовят и стерилизуют как указано в ГОСТ 28178. Пробирки со средой после стерилизации оставляют в наклонном положении так, чтобы высота столбика среды была не менее 3 см, а скошенная поверхность над ним - 5 см.

5.3.14.8 Сальмонеллезные агглютинирующие адсорбированные O-, Vi-, H-сыворотки

Необходимые разведения сыворотки готовят перед использованием согласно прилагаемым инструкциям изготовителя.

5.3.15 Питательные среды, растворы реактивов, эмульсии и дефибринированная кровь для выявления коагулазоположительных стафилококков и S. aureus

5.3.15.1 Солевой бульон

Жидкую селективную питательную среду солевой бульон для анализа функциональных пищевых продуктов и функциональных пищевых ингредиентов на молочной основе готовят по ГОСТ 30347, для других продуктов - по ГОСТ 31746.

5.3.15.2 Модифицированный бульон Жиолитти-Кантони

Жидкую селективную питательную среду модифицированный бульон Жиолитти-Кантони готовят по ГОСТ 31746.

5.3.15.3 Агар Байрд-Паркера

Дифференциально-диагностическую агаризованную среду Байрд-Паркера и используемые для ее приготовления 1%-ный раствор теллурита калия, 0,2%-ный раствор сульфаметазина в 1 М растворе гидроксида натрия готовят по ГОСТ 31746.

Дегидратированный агар Байрд-Паркера промышленного производства готовят согласно прописи на этикетке.

5.3.15.4 Желточно-солевой агар (ЖСА)

Дифференциально-диагностическую среду желточно-солевой агар (ЖСА) готовят по ГОСТ 30347.

5.3.15.5 Молочно-солевой агар

Дифференциально-диагностическую среду молочно-солевой агар (МСА) готовят по ГОСТ 30347.

5.3.15.6 Эмульсия яичного желтка

Эмульсию яичного желтка из свежих куриных яиц готовят по ГОСТ 31746.

Допускается использование готовой эмульсии яичного желтка промышленного производства, в этом случае эмульсию применяют в соответствии с инструкцией изготовителя.

5.3.15.7 Плазма крови кролика

Раствор плазмы крови кролика для определения способности выделенных культур коагулировать плазму крови готовят непосредственно перед использованием из плазмы крови кролика цитратной сухой в соответствии с инструкцией изготовителя.

Допускается использование плазмы из свежеполученной в асептических условиях крови из сердца кролика. В этом случае ее приготовление к использованию проводят по ГОСТ 31746.

5.3.15.8 Дефибринированная кровь животных

Для определения гемолитической активности выделенных культур используют стерильную дефибринированную кровь баранов, крупного рогатого скота, кроликов. Допускается использование свежевзятой крови лабораторных животных (кроликов, морских свинок), дефибринированной по ГОСТ 31746.

5.3.16 Питательные среды и растворы реактивов для определения количества плесневых грибов и дрожжей

5.3.16.1 Раствор солодового сусла с массовой долей сухих веществ (7,5 +/- 0,5)%

Сусло фильтруют через фильтрованную бумагу, разливают в колбы и стерилизуют (30 +/- 1) мин в автоклаве при (108 +/- 2) °C. Затем сусло декантируют. В прозрачном сусле определяют массовую долю сухих веществ ареометром-сахарометром, принимая каждые пять делений равными 1% сухих веществ, и разбавляют водой до массовой доли сухих веществ (7,5 +/- 0,5)%, разливают в колбы и стерилизуют при (116 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин. Солодовое сусло можно заменить виноградным суслом, которое готовят аналогично солодовому.

5.3.16.2 Сусловый агар

К 1,0 дм³ солодового сусла с массовой долей сухих веществ (7,5 +/- 0,5)% прибавляют 30 г агара. Среду нагревают до полного расплавления агара и фильтруют через вату или фильтровальную бумагу. Охлаждают до (50 +/- 5) °C и устанавливают pH так, чтобы при температуре 25 °C он составлял (3,6 +/- 0,1) ед. с помощью молочной кислоты. Фильтрат разливают в колбы и стерилизуют при (116 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.

5.3.16.3 Среда Сабуро

К 1,0 дм³ дистиллированной воды добавляют 18 г агара и оставляют на 30 мин для его набухания, затем 40 г мальтозы или глюкозы и 10 г пептона, нагревают до полного растворения (при наличии осадка фильтруют). Устанавливают pH так, чтобы при температуре 25 °C он составлял (6,5 +/- 0,1) ед. pH с помощью молочной кислоты. Разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при (116 +/- 1) °C в течение (20 +/- 1) мин.

5.3.16.4 Сывороточный агар - среду готовят на основе сывороточного агара БФ по ГОСТ 10444.12, используют при анализе пробиотических продуктов на молочной основе.

5.3.16.5 Для повышения селективности среды Сабуро по 5.3.16.3 и сывороточного агара по 5.3.16.4 непосредственно перед использованием в них добавляют водные растворы антибиотиков, приготовленные по 5.3.16.7 - 5.3.16.10.

Растворы антибиотиков вносят в расплавленные и охлажденные до (46 +/- 1) °C питательные среды по схеме, указанной в таблице 1.

 

Таблица 1

 

Схема добавления растворов антибиотиков в среду Сабуро

и сывороточный агар

 

Объем питательной среды, см3	Объемы вносимых в среду растворов антибиотиков, см3
	пенициллин	стрептомицин	неомицин	хлорамфеникол (левомицетин)
980	10	10	-	-
930	-	-	70	-
975	-	-	-	25

 

Среды с антибиотиками хранению не подлежат.

5.3.16.6 Агар с дихлораном, бенгальским розовым, хлорамфениколом и хлортетрациклина гидрохлоридом готовят по ГОСТ 10444.12.

5.3.16.7 Приготовление водного раствора пенициллина

Во флакон с бензилпенициллина натриевой или калиевой солью, содержащим 500000 ЕД, добавляют 5 - 7 см³ стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивают до растворения. Содержимое флакона переносят в стерильную мерную колбу, вместимостью 100 см³, и доводят до метки стерильной дистиллированной водой при температуре от 35 °C до 40 °C. Получают раствор пенициллина, содержащий 5000 ЕД/см³.

При использовании пенициллина другой активности, его растворяют в мерной колбе соответствующей вместимости до 5000 ЕД/см³.

Раствор готовят непосредственно перед внесением в среду.

5.3.16.8 Приготовление водного раствора стрептомицина

400 мг стрептомицина сульфата или дигидрострептомицина сульфата вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 10,0 - 20,0 см³ стерильной дистиллированной воды при температуре от 35 °C до 40° С, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация стрептомицина в растворе 4 г/дм³. Раствор готовят непосредственно перед внесением в среду.

5.3.16.9 Приготовление водного раствора неомицина

500 мг неомицина сульфата вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 10,0 - 20,0 см³ стерильной дистиллированной воды при температуре от 35 °C до 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация неомицина в растворе 5 г/дм³. Раствор готовят непосредственно перед внесением в среду.

5.3.16.10 Приготовление водного раствора хлорамфеникола (левомицетина)

400 мг хлорамфеникола (левомицетина) вносят в стерильную мерную колбу вместимостью 100 см³, добавляют 10,0 - 20,0 см³ стерильной дистиллированной воды при температуре от 35 °C до 40 °C, перемешивают до растворения, затем доливают стерильной дистиллированной водой до метки. Массовая концентрация хлорамфеникола в растворе 4 г/дм³. Раствор готовят непосредственно перед внесением в среду.

5.3.16.11 Приготовление 1%-ного спиртового раствора хлорамфеникола - 1%-ный спиртовый раствор хлорамфеникола готовят и применяют по ГОСТ 10444.12.

5.3.16.12 Приготовление 0,1%-ного водного раствора хлортетрациклина гидрохлорида - 0,1%-ный водный раствор хлортетрациклина гидрохлорида готовят и применяют по ГОСТ 10444.12.

5.3.17 Питательные среды и растворы реактивов для выявления L. monocytogenes

5.3.17.1 Бульоны Фрейзера для первичного селективного обогащения (полуконцентрированный) и вторичного селективного обогащения (с полной концентрацией селективных компонентов) листерий готовят в соответствии с ГОСТ 32031.

Готовые среды разливают в стерильные колбы: полуконцентрированный бульон Фрейзера - в объемах, в 9 раз превышающих массу (объем) засеваемого продукта; бульон Фрейзера с полной концентрацией селективных компонентов - по 90 см³, и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 6 °C не более трех недель.

5.3.17.2 Селективный накопительный бульон (UVM), питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ I) для первичного селективного обогащения и селективный накопительный бульон (UVM II), питательный бульон для выделения и культивирования листерий (ПБЛ II) для вторичного селективного обогащения листерий готовят в соответствии с ГОСТ 32031.

5.3.17.3 Агар Listeria по Оттавиани и Агости (ALOA) - основную (первую) селективную дифференциально-диагностическую плотную среду для выделения листерий готовят в соответствии с ГОСТ 32031.

5.3.17.4 PALCAM-arap (полимиксин-акрифлавин-лития хлорид-цефтазидим-эскулин-маннитол - агар) - дополнительную (вторую) селективную дифференциально-диагностическую плотную среду для выделения листерий готовят в соответствии с ГОСТ 32031.

Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C.

5.3.17.5 Оксфорд-агар - дополнительную (вторую) селективную дифференциально-диагностическую плотную среду для выделения листерий готовят в соответствии с ГОСТ 32031.

При приготовлении среды допускается замена комплекса рекомендованных в 5.3.16.5 на полимиксин B сульфат в количестве 500000 ME на 1 дм³ среды.

Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C.

5.3.17.6 Питательный агар для выделения листерий (ПАЛ) - дополнительную (вторую) селективную дифференциально-диагностическую плотную среду для выделения листерий готовят в соответствии с ГОСТ 32031.

5.3.17.7 Питательный агар с 1% глюкозы (МПА с 1% глюкозы) и питательный бульон с 1% глюкозы (МПБ с 1% глюкозы) - для изучения культурально-морфологических свойств листерий готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1, в том числе из сухих основ промышленного производства - по 5.3.11.

5.3.17.8 Трипказо-соевый бульон (TSB) и трипказо-соевый агар (TSA) - для изучения культурально-морфологических свойств листерий готовят в соответствии с ГОСТ 32031.

5.3.17.9 Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB)/Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) для изучения культурально-морфологических свойств листерий готовят в соответствии с ГОСТ 32031.

5.3.17.10 Кровяной агар для определения гемолитических свойств листерий

К растопленному и охлажденному до 45 - 50 °C питательному агару с 1% глюкозы (см. 5.3.17.8) добавляют 5% по объему дефибринированной крови барана (см. 5.3.15.8). Разливают в чашки Петри диаметром 90 мм по 15 см³ среды и подсушивают при 37 °C. Посев производят в теплые чашки.

5.3.17.11 Питательный агар с эритроцитами барана для определения активности Listeria monocytogenes

Дефибринированную или стабилизированную цитратом кровь барана центрифугируют в асептических условиях 30 мин при 900 об/мин. Надосадочную жидкость сливают. Осадок суспендируют в стерильном изотоническом растворе хлористого натрия до первоначального объема, добавляют в количестве 5% по объему к растопленному и охлажденному до 45 °C - 50 °C питательному агару. Разливают в чашки Петри по 10 см³, подсушивают при 37 °C. Чашки используют для посева теплыми.

5.3.17.12 Среда для определения подвижности - среда для изучения физиолого-биохимических свойств листерий <*>

--------------------------------

<*> Среда может использоваться также для определения подвижности бактерий рода Salmonella.

 

20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 см³ дистиллированной воды, устанавливают pH так, чтобы при температуре 25 °C после стерилизации его значение составляло (7,3 +/- 0,2) ед. pH, разливают в пробирки по 5 - 7 см³ и автоклавируют 15 мин при температуре 121 °C.

5.3.17.13 Среды Гисса с маннитом, рамнозой, ксилозой

Среды Гисса с маннитом, рамнозой, ксилозой - для изучения ферментативных свойств и идентификации бактерий Listeria monocytogenes готовят по ГОСТ 10444.1.

5.3.17.14 Среды для определения лецитиназной активности листерий (лецитин-агар)

Готовят основы сред в двух вариантах:

1-й вариант - к среде ГРМ-агар (ГРМ N 1), приготовленной по 5.3.11, перед стерилизацией добавляют активированный уголь, растертый до порошкообразного состояния, до концентрации 0,5% (вес/объем).

2-й вариант - готовят аналогично, но без добавления активированного угля.

К стерилизованной и охлажденной до 40 °C - 50 °C первому варианту основы питательной среды в условиях асептики добавляют эмульсию желтка куриного яйца, приготовленную по ГОСТ 32031, в количестве 5% по объему. Разливают в чашки Петри по 20 см³ и подсушивают при 37 °C.

Аналогично готовят среду на втором варианте основы с добавлением желтка, но без добавления активированного угля.

5.3.17.15 Среды для проведения КАМП (CAMP) теста для идентификации бактерий Listeria monocytogenes готовят по ГОСТ 31031.

5.3.17.16 Раствор с объемной долей перекиси водорода 3% готовят по ГОСТ 10444.1.

 

5.4 Приготовление разведений продуктов для посева

 

5.4.1 К 10 г лабораторной пробы добавляют по 10 г (см³) стерильный изотонический раствор хлористого натрия или разбавленный фосфатный буферный раствор до достижения общей массы или объема пробы 100 г (см³), после чего смесь тщательно перемешивают до гомогенного состояния вручную круговыми движениями либо с использованием аппарата для встряхивания жидкостей или гомогенизатора перистальтического типа. Пипетку осторожно промывают до 10 раз полученной смесью до верхнего уровня имеющихся на ней делений. Получают первое разведение продукта (1 x 10^-1).

5.4.2 При анализе сыров и творожных продуктов, обогащенных пробиотическими микроорганизмами, для приготовления разведений используют раствор лимоннокислого натрия по 5.3.7.

5.4.3 Первое разведение для сухих кисломолочных продуктов и БАД на основе пробиотических микроорганизмов, высушенных со средой культивирования, нейтрализуют. Для этого на каждые 10 см³ разведения в стерильную посуду добавляется 1,0 см³ стерильного раствора натрия гидрокарбоната с массовой концентрацией 100 г/дм³; содержимое перемешивают с использованием стерильных приспособлений или шуттель-аппарата. Общая масса первого разведения пробы с разбавителем и нейтрализующим раствором должна составлять 100 г.

5.4.4 При анализе продуктов, обогащенных пробиотическими микроорганизмами в капсулированном виде, первое разведение капсул суспендируют. Для этого 10 г образца капсул переносят в 90 г разбавленного фосфатного буферного раствора, нагретого до температуры не выше 40 °C. Допускается использование гомогенизатора перистальтического типа, время гомогенизации 2 - 2,5 мин.

5.4.5 При анализе продукции, обогащенной пробиотическими микроорганизмами в микрокапсулированной форме, при приготовлении первого разведения необходимо освободить микроорганизмы от покрытий путем растворения последних.

5.4.6 В случае покрытия из полисахаридов, необходимо энергичное смешивание в течение 10 - 15 мин круговыми движениями.

5.4.7 В случае двойного покрытия из полисахаридов и белков/пептидов перемешивание первого разведения должно продолжаться не менее 21 мин: осторожное размешивание (без образования пузырьков) в течение двух минут, отстаивание в течение пяти минут, операции повторяют три раза для полного растворения покрытия.

5.4.8 Далее проверяют состояние покрытий под микроскопом (x 1000). Если покрытия полностью не растворились или клетки остались в агрегированном состоянии, процедуру повторяют.

5.4.9 При необходимости последующие десятикратные разведения продукта готовят, добавляя в 9 см³ стерильного разбавителя (изотонического раствора хлористого натрия, разбавленного фосфатного буферного раствора или раствора лимоннокислого натрия) по 1 см³ из предыдущего разведения продукта. При этом смесь каждый раз тщательно перемешивают, осторожно промывая пипетку до 10 раз полученной смесью. Для приготовления каждого разведения берут новую стерильную пипетку, при этом вводят пипетку в пробирку не более, чем на 2 - 3 см ниже поверхности смеси.

Время от момента приготовления разведений до посева не должно превышать 30 мин. Перед посевом приготовленные разведения осторожно встряхивают.