ГОСТ Р 56139-2014. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые специализированные и функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов

9 Методы идентификации пробиотических микроорганизмов

 

9.1 В процессе идентификации определяются основные фенотипические признаки чистой культуры штамма: культуральные свойства колоний, морфология клеток в микроскопических препаратах, отношение к окраске по Граму, способность к спорообразованию, а также каталазная активность при использовании общепринятых в микробиологии методов анализа, для чего культуру микроорганизма выделяют в чистом виде.

Чистую культуру штамма выделяют на питательной среде, предназначенной для данного вида микроорганизма, позволяющей получать изолированные колонии. Культивирование изолятов бактерий рода Lactobacillus осуществляется на среде МРС (MRS), бактерий рода Streptococcus и Lactococcus - среде типа М-17 или среде Ли (Lee), бактерий рода Bifidobacterium - среде Блаурокка, тиогликолевой, гидролизатно-молочной, кукурузно-лактозной, Бифидум-среде, среде МРС (MRS) с диклоксациллином, TOS-MUP-агаре.

Описание характерных культуральных признаков роста пробиотических микроорганизмов на питательных средах приведено в приложении А.

9.2 Окрашивание по Граму

Приготовление мазков-препаратов и окрашивание проводят по ГОСТ ISO 7218.

9.3 Проба на каталазу

9.3.1 Определение каталазной активности микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах

На предметное стекло наносят отдельно две капли раствора перекиси водорода с массовой долей 3% (1:10 по объему). Отделяют колонию от среды стерильным стеклом или пластиковой палочкой (но не металлической иглой) и осторожно суспендируют ее в одной из капель. Немедленно, а также через несколько минут (но не менее одной минуты) отмечают отсутствие или образование пузырьков кислорода. В сомнительном случае покрывают обе капли предметным стеклом и сравнивают наличие пузырьков в обеих каплях. Наблюдение проводят визуально или с помощью микроскопа при малом увеличении.

9.3.2 Определение каталазной активности микроорганизмов, выросших на жидких (в стерильном молоке) и полужидких питательных средах

Из посевов отбирают 2 - 3 см³ культуральной жидкости, переносят ее в пробирку и нейтрализуют 10%-ным раствором гидроокиси натрия или соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Одну-две капли нейтрализованной культуральной жидкости пипеткой переносят на предметное стекло и после выдержки на воздухе в течение 30 мин добавляют к ней каплю 3%-ного раствора перекиси водорода.

Если в посевах обнаружены газообразующие микроорганизмы, то при определении их каталазной активности ставят контрольную пробу аналогично пробе на каталазу, но без добавления перекиси водорода. В данном случае газообразующие микроорганизмы относят к каталазаположительным при отсутствии пузырьков газа в контрольной пробе или при явно повышенном газообразовании в пробе с перекисью водорода по сравнению с контрольной пробой.

9.4 Определение подвижности

Определение подвижности микроорганизмов, выросших на плотных питательных средах, проводят по ГОСТ 10444.11.

9.5 Биохимические исследования фенотипических свойств штаммов

9.5.1 Исследования проводят при необходимости подтверждения принадлежности к роду и дифференциации видов пробиотических микроорганизмов с помощью биохимических диагностических тест-панелей (планшет) одноразового использования промышленного производства по ГОСТ ISO 7218.

Каждую партию тест-панелей контролируют при использовании чистых культур типовых штаммов пробиотических микроорганизмов - типичных представителей родов Bifidobacterium, Lactobacillus, Propionibacterium, Lactococcus, а также штаммов вида Streptococcus thermophilus.

9.5.2 Из чистых 18 - 24-часовых культур анализируемых пробиотических микроорганизмов асептично готовят суспензию в прилагаемом разбавителе, входящим в набор диагностической тест-панели, тщательно гомогенизируют и доводят до определенной мутности по шкале МакФарланда прилагаемых стандартов (в соответствии с инструкцией) в зависимости от вида анализируемого штамма. Неправильно приготовленная суспензия (слишком густая или очень жидкая) может привести к получению ложных результатов.

При необходимости параллельно суспензию тестируемого штамма и контрольного штамма высевают на питательные среды для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств и/или постановки дополнительных тестов.

Планшет для идентификации извлекают из упаковки и на прилагаемом к планшету бланке регистрируют номер анализируемого штамма.

Суспензию бактерий тщательно перемешивают круговыми движениями и в каждую лунку инокулируют определенный объем суспензии (0,1 - 0,2 см³) в зависимости от требований фирмы-изготовителя и вида анализируемого штамма.

При необходимости после инокуляции для создания анаэробных условий в лунки вносят стерильное вазелиновое масло, полностью закрывая внесенную суспензию бактериальных клеток.

После инокуляции планшет накрывают крышкой и инкубируют 5 - 24 ч при оптимальной температуре и атмосфере для анализируемого вида микроорганизмов.

По окончании инкубации результаты учитывают визуально, отмечая цвет каждой лунки, и заносят в прилагаемые бланки. При необходимости вносят реактивы для проявления анализируемого признака. Учет результатов на бета-галактозидазу проводят дважды: через 3 - 5 ч и через 18 - 24 ч.

Интерпретацию результатов для определения родовой и видовой принадлежности анализируемого штамма проводят с помощью таблиц, книг-каталогов кодов, компьютерного обеспечения соответствующих фирм-изготовителей.

9.5.3 При получении вариабельных результатов тестов идентификации необходимо проверить стабильность биохимических свойств пробиотических микроорганизмов методом пассирования микроорганизма на жидких и плотных питательных средах (3 - 5 пассажей) и дальнейшим трехкратным тестированием на тест-панелях. Трехкратное совпадение всех исследованных биохимических реакций, выявленное после пассирования культур, будет свидетельствовать о стабильности фенотипических признаков, как указано в [7], [8].

Вариабельность результатов свидетельствует о нестабильности фенотипических признаков у пробиотического микроорганизма.

9.5.4 Для ориентировочной идентификации видовой принадлежности бифидобактерий допускается применение тест-систем промышленного изготовления. Для тестирования бифидобактерий предпочтительно использовать параллельно не менее двух наборов тест-панелей по 5.3. Ферментативные свойства бифидобактерий, наиболее часто используемых при производстве специализированных и функциональных пищевых продуктов (B. bifidum, B. longum, B. breve, B. infantis, B. adolescentis, B. animalis), приведены в приложении Б.