ГОСТ Р 56139-2014. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые специализированные и функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов

8.4 Определение количества отдельных групп пробиотических микроорганизмов

8.4.1 Бактерии рода Lactobacillus

8.4.1.1 Для определения количества бактерий рода Lactobacillus в анализируемом продукте, его разведения, приготовленные согласно 7.4, высевают методом поверхностного посева по 8.1 в чашки Петри с плотной питательной средой МРС (MRS) или методом глубинного посева по 8.2 в пробирки с полужидкой питательной средой МРС (MRS). Для представителей гомоферментативных видов бактерий рода Lactobacillus допускается также осуществлять посев в стерильное обезжиренное молоко. Посевы инкубируют 72 ч при температуре (37 +/- 1) °C с ограничением доступа кислорода.

8.4.1.2 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно. Подсчет колоний проводят через 72 ч. Для подсчета колоний отбирают чашки Петри, на которых выросло от 10 до 300 характерных колоний, или пробирки с тремя конечными разведениями, в которых наблюдают рост микроорганизмов. Характеристика колоний приведена в приложении А. При посеве на стерильное молоко критерием роста является сворачивание молока.

8.4.1.3 Из выросших колоний на чашках или из трех последних разведений с признаками роста при посеве на полужидкую среду или стерильное молоко готовят препараты, окрашивают по Граму по 9.2. Наличие каталазы определяют по 9.3, подвижность по 9.4.

При обнаружении специфичных для бактерий рода Lactobacillus неспорообразующих, грамположительных, неподвижных, каталазаотрицательных палочек, проводят подсчет числа или определение наиболее вероятного числа бактерий рода Lactobacillus по 10.

8.4.1.4 При необходимости для получения чистых культур из чашек и пробирок с признаками роста производят пересев на агаризованную среду МРС (MRS) так, чтобы получить рост изолированных колоний. Отбирают типичные колонии и пересевают их на среду МРС (MRS), инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C с ограничением доступа кислорода, после чего подвергают дальнейшему изучению по 9.5. При необходимости подтверждения принадлежности к роду Lactobacillus и/или дифференциации видов используют методы идентификации микроорганизмов с помощью биохимических диагностических тест-панелей промышленного производства, обеспечивающих получение профиля ферментации расширенного набора углеводов и аминокислот не менее чем по 49 тестам.

8.4.2 Бактерии рода Bifidobacterium

8.4.2.1 Для определения количества бактерий рода Bifidobacterium в анализируемом продукте разведения, приготовленные согласно 7.4, высевают методом глубинного посева в пробирки с одной из полужидких селективных питательных сред по 6.3.3.1 или в чашки Петри с одной из плотных селективных питательных сред по 6.3.3.2. Посевы инкубируют в анаэробных условиях при температуре (37 +/- 1) °C в течение 72 ч.

Предварительный учет результатов проводят через 24 - 48 ч инкубирования, окончательный подсчет количества бактерий рода Bifidobacterium проводят через 72 ч культивирования.

Посевы просматривают и отмечают рост колоний, характерных для бактерий рода Bifidobacterium, затем проводят подсчет всех типов выросших колоний. Характеристика колоний бифидобактерий и признаков роста на питательных средах приведена в приложении А.

Для подсчета колоний отбирают чашки Петри, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний или пробирки с тремя конечными разведениями, в которых наблюдают характерный рост микроорганизмов. Для получения изолированных колоний производят пересев всех типов колоний, выросших на чашках Петри или в пробирках с полужидкими средами, в пробирки с неселективными средами для культивирования по 6.3.3.3, разлитыми высоким столбиком или чашки с агаризованными средами для бифидобактерий, приготовленными без добавления селективных агентов.

Если в посевах первой генерации в пробирках и на чашках имеются четко изолированные колонии, допускается их отбирать для дальнейшего изучения без рассева.

В случае диффузного недифференцированного роста в пробирках с полужидкими средами допускается производить пересев 1 см³ культуральной жидкости в пробирки с полужидкими или на чашки с агаризованными селективными средами для бифидобактерий.

Посевы инкубируют в анаэробных условиях при 37 °C в течение 24 - 48 ч.

8.4.2.2 Подтверждение наличия бактерий рода Bifidobacterium методом микроскопирования

По окончании инкубации отбирают все типы изолированных колоний (из пробирок - пастеровской пипеткой, с чашек - бактериологической петлей), имеющие морфологическое сходство с колониями бактерий рода Bifidobacterium согласно приложению А.

Из выросших колоний готовят мазки-препараты, окрашивают по Граму, определяют наличие каталазы по 8.2.2. При обнаружении в препаратах клеток грамположительных палочек, неспорообразующих, прямых, изогнутых или разветвленных, Y- или V-образной формы, булавовидных; расположенных одиночно, цепочками, или скоплениями в виде "китайских иероглифов", и при отрицательном тесте на каталазу колонии относят к бактериям рода Bifidobacterium и проводят обработку результатов по 10.

При необходимости проводят дальнейшую идентификацию культур биохимическим методом и анализируют профиль ферментации углеводов и аминокислот по 9.4.

8.4.3 Бактерии рода Lactococcus и вида Streptococcus thermophilus

Для определения количества бактерий рода Lactococcus и бактерий вида Streptococcus thermophilus из анализируемого продукта отбирают пробу по 7.3 и готовят необходимые разведения по 7.4. Разведения высевают поверхностным по 8.1.1 или глубинным методом по 8.1.2 на чашки с одной из агаризованных сред, указанных в 6.3.4.

Засеянные чашки после застывания агара переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Посевы инкубируют (72 +/- 3) ч при температуре (30 +/- 1) °C для определения бактерий рода Lactococcus, и (48 +/- 3) ч при температуре (37 +/- 1) °C для определения бактерий вида Streptococcus thermophilus. При наличии в продукции одновременно бактерий рода Lactococcus и бактерий вида Streptococcus thermophilus, параллельно делают 2 посева, используя питательную среду М-17, pH которой при посеве для определения бактерий рода Lactococcus должен быть установлен на уровне (7,2 +/- 0,1) ед. pH при температуре 25 °C, а для определения бактерий вида Streptococcus thermophilus - на уровне (6,8 +/- 0,1) ед. pH. Посевы инкубируют пять дней при температуре (20 +/- 1) °C для определения бактерий рода Lactococcus, и (48 +/- 3) ч при температуре (45 +/- 1) °C для определения бактерии вида Streptococcus thermophilus.

После инкубирования посевы просматривают и отмечают рост колоний, характерных для бактерий рода Lactococcus и бактерий вида Streptococcus thermophilus, затем проводят подсчет выросших колоний. Для подсчета колоний отбирают чашки Петри, на которых выросло от 10 до 300 характерных колоний. Характеристика колоний приведена в приложении А.

Результаты оценивают визуально по каждой пробе отдельно.

Из выросших колоний готовят препараты, окрашивают по Граму по 9.2, наличие каталазы определяют по 9.3, подвижность определяют по 9.4.

При наличии в препаратах специфичных по морфологии клеток (грамположительных неспорообразующих кокков, расположенных парами, короткими или длинными цепочками), отрицательном тесте на каталазу, отрицательном тесте на подвижность колонии относят к Lactococcus или Streptococcus thermophilus и проводят обработку результатов по 10.

При необходимости отбирают культуры для дальнейшего изучения биохимическим методом по 9.5.

8.4.4 Бактерии рода Propionibacterium

Для определения количества бактерий рода Propionibacterium из анализируемого пищевого продукта отбирают пробу по 7.3 и готовят необходимые разведения по 7.4, высевают глубинным методом по 8.1.3 на питательные среды, указанные в 6.3.4.

Посевы для определения бактерий рода Propionibacterium инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 - 48 ч с ограничением доступа кислорода, предварительный подсчет колоний проводят через 24 - 27 ч.

Допускается при посеве на агаризованную питательную среду для определения бактерий рода Propionibacterium инкубировать посевы при температуре (30 +/- 1) °C в течение 72 ч.

После инкубирования посевы просматривают и отмечают рост колоний, характерных для бактерий рода Propionibacterium. Характеристика колоний приведена в приложении А.

Из выросших колоний готовят препараты, окрашивают по Граму по 9.2. Наличие каталазы определяют по 9.3, подвижность по 9.4.

Результаты оценивают визуально по каждой пробе отдельно. При наличии в посевах каталазоположительных, неспорообразующих, грамположительных, неподвижных палочек, располагающихся поодиночке, парами, в виде букв V или Y, короткими цепочками или группами в виде "китайских иероглифов", проводят обработку результатов по 10.

При необходимости отбирают культуры для дальнейшего изучения биохимическим методом по 9.5.