ГОСТ Р 56139-2014. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые специализированные и функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов

6.3 Приготовление питательных сред для культивирования пробиотических микроорганизмов

6.3.1 Среды сухие промышленного производства, указанные 5.3, готовят согласно рекомендациям изготовителей, указанным на этикетках. Допускается применение аналогичных сред лабораторного приготовления из отдельных компонентов.

6.3.2 Приготовление питательных сред для культивирования бактерий рода Lactobacillus

6.3.2.1 Среда МРС (MRS) агаризованная

Среду готовят по ГОСТ 10444.11.

6.3.2.2 Среда МРС (MRS) полужидкая

Среду готовят аналогично агаризованной, но с добавлением 0,6% - 0,7% агара.

6.3.2.3 Стерилизованное обезжиренное молоко

Обезжиренное молоко (кислотностью от 16 °T до 18 °T) разливают в пробирки по 10,0 см³ и затем стерилизуют в автоклаве при (115 +/- 1) °C в течение (10 +/- 1) мин.

6.3.3 Приготовление питательных сред для культивирования бактерий рода Bifidobacterium

6.3.3.1 Среды селективные для выделения бифидобактерий

а) Модифицированная печеночно-цистеиновая среда Блаурокка

Среду готовят по ГОСТ 33491.

б) Тиогликолевая среда

В 1000 см³ дистиллированной воды вносят 15,0 г ферментативного сухого гидролизата казеина неглубокой степени расщепления (триптона), 5,0 г сухого дрожжевого экстракта, 2,5 г хлорида натрия, 0,75 г микробиологического агара, размешивают и нагревают до температуры 60 °C - 70 °C. L-цистеин предварительно растворяют при постепенном добавлении раствора гидроокиси натрия (до полного растворения). Раствор цистеина вносят в приготовленную смесь, устанавливают активную кислотность 8,0 - 8,2 ед. pH с помощью раствора гидроокиси натрия, кипятят в течение двух-трех минут до полного расплавления агара. Добавляют 5,0 г глюкозы и 0,3 см³ тиогликолевой кислоты (или натрия тиогликолята - 0,5 г), фильтруют через фильтровальную бумагу, устанавливают pH 7,2 - 7,3 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты. Среду разливают в стерильные пробирки высоким столбиком и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °C в течение 15 мин. Готовую среду хранят в защищенном от света месте при температуре 18 °C - 25 °C.

в) Бифидум-среда

Среду готовят согласно прописи производителя, указанной на этикетке.

6.3.3.2 Среды селективные для определения количества бифидобактерий в продуктах со смешанной технологической микрофлорой.

а) В качестве селективного агента для ингибиции роста сопутствующих биотехнологических микроорганизмов используют добавки антибиотиков и редуцирующие агенты, снижающие окислительно-восстановительный потенциал питательной среды.

б) TOS-MUP агар (TOS пропионатный агар с мупироцином лития)

Среду готовят по ГОСТ ISO 29981.

в) Питательная среда МРС (MRS) с диклоксациллином

- Приготовление раствора селективного агента

25 мг диклоксациллина растворяют в 50 см³ дистиллированной воды, затем полученный раствор стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 при использовании мембранных фильтров с размером пор 0,2 мкм, срок хранения раствора - 15 сут при температуре 4 °C.

Допускается готовить раствор диклоксациллина без фильтрации с соблюдением правил асептики, при этом диклоксациллин в асептических условиях растворяют в стерильной дистиллированной воде.

Непосредственно перед использованием готовят рабочее разведение этого раствора 1:10.

- Приготовление антиоксидантного раствора

Растворяют 3 г L-цистеина гидрохлорида в 100 см³ дистиллированной воды, затем полученный раствор стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 при использовании мембранных фильтров с размером пор 0,2 мкм. Раствор разливают по 10 см³ в стерильные пробирки. Хранят раствор 15 сут при температуре 4 °C.

Допускается готовить раствор L-цистеина без фильтрации с соблюдением правил асептики, при этом в асептических условиях растворяют L-цистеин гидрохлорид в стерильной дистиллированной воде.

- Приготовление питательной среды МРС (MRS).

Среду готовят по 6.3.2.1 и разливают в бутылки или флаконы по 100 см³.

Перед использованием среду расплавляют и выдерживают в кипящей водяной бане в течение 20 мин для регенерации среды. Затем среду охлаждают до температуры 40 °C - 45 °C, после чего вносят на каждые 100 см³ среды по 1 см³ раствора селективного агента и 1 см³ раствора антиоксиданта. Смесь аккуратно перемешивают, не допуская насыщения среды воздухом.

6.3.3.3 Среды неселективные для культивирования изолятов бифидобактерий

а) Гидролизатно-молочная среда

Среду готовят в два этапа.

- Натуральное или восстановленное обезжиренное молоко кипятят в течение (2 +/- 1) мин и охлаждают до температуры (45 +/- 2) °C. Доводят активную кислотность до pH (7,7 +/- 0,1), добавляя водный раствор гидроокиси натрия. К 1000 см³ молока добавляют 1,0 г порошка панкреатина. Затем к молоку добавляют от 5 до 6 см³ хлороформа. Колбу закрывают корковой пробкой и выдерживают при температуре (40 +/- 2) °C в течение 18 - 24 ч. В течение первых 3 - 5 ч молоко 2 - 3 раза перемешивают (пробку после перемешивания приоткрывают для удаления хлороформа).

Затем гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр, разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1, устанавливают активную кислотность pH (7,1 +/- 0,1), добавляя водный раствор гидроокиси натрия. В случае хранения гидролизованное молоко стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

- Приготовление гидролизатно-молочной среды

В небольшом количестве разведенного гидролизата молока расплавляют агар в количестве 2,5 г на 1000 см³ приготовляемой среды. К остальному количеству гидролизата добавляют 20 г пептона и 3,5 г хлористого натрия, смесь нагревают до температуры (80 +/- 2) °C, после чего соединяют с расплавленным агаром. В смеси устанавливают активную кислотность (7,4 +/- 0,1) ед. pH, кипятят в течение (15 +/- 1) мин, дают отстояться, сливают с осадка, не фильтруя, доливают горячей дистиллированной водой до заданного объема и добавляют в нее 10 г лактозы и 0,15 г солянокислого цистина. Среду разливают в пробирки высоким столбиком и стерилизуют при температуре (112 +/- 1) °C в течение (30 +/- 1) мин, pH готовой среды (7,1 +/- 0,1) ед. pH при 25 °C.

б) Кукурузно-лактозная среда.

Среду готовят по ГОСТ 33491.

6.3.4 Приготовление питательных сред для культивирования бактерий рода Lactococcus и вида Streptococcus thermophilus

6.3.4.1 Приготовление среды Ли (Lee)

Среду готовят по ГОСТ 10444.11.

6.3.4.2 Приготовление питательной среды М-17

а) Основа среды

В 950 см³ дистиллированной воды на кипящей водяной бане растворяют 2,5 г триптического перевара казеина (триптона), 2,5 г пептического перевара мяса (пептона), 5,0 г перевара папаинового сои (пептона соевого), 2,5 г дрожжевого экстракта, 5,0 г мясного экстракта, 19,0 г глицерофосфата натрия (C₃H₇O₆PNa₂), 0,25 г сернокислого магния (MgSO₄·7H₂O), 0,5 г аскорбиновой кислоты, 9 - 18 г агара, охлаждают на другой водяной бане до 50 °C. Устанавливают активную кислотность среды таким образом, чтобы после стерилизации при 25 °C pH был в пределах (6,8 +/- 0,1) ед. pH при посеве на Lactococcus spp. или (7,2 +/- 0,1) ед. pH - при посеве на Streptococcus thermophilus. Готовую среду разливают в лабораторную посуду соответствующей вместимости по 95 см³. Стерилизуют в автоклаве при (121 +/- 1) °C в течение (15 +/- 1) мин.

б) Раствор лактозы

10,0 г лактозы растворяют в 100,0 см³ дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве при (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

в) Приготовление среды

Непосредственно перед использованием расплавляют 95 см³ основной среды в водяной бане и быстро охлаждают до 48 °C - 50 °C. Подогревают 5 см³ раствора лактозы до 48 °C - 50 °C. Добавляют раствор лактозы к основной среде и перемешивают.

6.3.5 Приготовление питательных сред для культивирования бактерий рода Propionibacterium

6.3.5.1 Плотная кукурузно-лактозная среда готовится по ГОСТ 33491.

6.3.5.2 Агаризованная питательная среда для определения пропионовокислых бактерий

В (1000 +/- 50) см³ воды вносят 30 г пептона, 1 г дрожжевого автолизата, 20 г агара. Смесь тщательно перемешивают, затем нагревают и кипятят до расплавления агара, не допуская пригорания. Добавляют 20 см³ 40%-ного раствора молочной кислоты. В полученной среде проверяют активную кислотность и доводят ее раствором гидроокиси натрия до значения (7,1 +/- 0,1) ед. pH. Среду перемешивают, разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 +/- 2) °C в автоклаве в течение (15 +/- 1) мин.