ГОСТ 32709-2014. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Методы определения антоцианинов

6. Метод pH-дифференциальной спектрофотометрии

 

6.1 Сущность метода

Метод основан на применении pH-дифференциальной спектрофотометрии. Массовую концентрацию (массовую долю) суммы антоцианинов в пересчете на цианидин-3-глюкозид в соковой продукции определяют на основе изменения поглощения света с длиной волны 510 нм при изменении кислотности растворов соковой продукции от 1 до 4,4 ед. pH.

6.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

6.2.1 Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения в диапазоне длин волн от 200 до 900 нм, с допустимой абсолютной погрешностью измерения коэффициента пропускания +/- 1%.

6.2.2 Кюветы кварцевые для спектрофотометрии с длиной оптического пути 10 мм.

6.2.3 Установка ультразвуковая с частотой ультразвука 43 - 45 кГц.

6.2.4 Аппарат для встряхивания проб.

6.2.5 Весы лабораторные по ГОСТ OIML R 76-1 специального (1-го) класса точности с наибольшим пределом взвешивания не более 150 г со значением среднеквадратического отклонения (СКО), не превышающим 0,03 мг и пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,001 г.

6.2 Весы лабораторные по ГОСТ OIML R 76-1 высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания не более 150 г со значением среднеквадратического отклонения (СКО), не превышающим 0,05 мг и пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,005 г.

6.2.7 pH-метр по ГОСТ 9245 с диапазоном измерений от 2 до 14 ед. pH, погрешностью измерений не более 0,05 ед. pH и снабженный комбинированным стеклянным электродом.

6.2.8 Фильтры мембранные с диаметром пор 0,45 мкм.

6.2.9 Центрифуга лабораторная с фактором разделения не менее 1000g.

6.2.10 Пробирки полимерные центрифужные с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см³.

6.2.11 Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2 по ГОСТ 1770.

6.2.12 Пипетки 4-1-2 или 5-1-2, 4-2-10 или 5-2-10, 4-2-25 или 5-2-25 по ГОСТ 29227.

6.2.13 Вода по ГОСТ ИСО 3696, не ниже 2-й степени чистоты.

6.2.14 Цианидин-3-O-глюкозид (куромаин) хлористый для ВЭЖХ C₂₁H₂₁ClO₁₁, массовой долей основного вещества не менее 95%.

6.2.15 Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, ч.д.а.

6.2.16 Калий хлористый по ГОСТ 4234, ч.д.а.

6.2.17 Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также посуды, реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

6.3 Проведение измерений

6.3.1 Условия проведения измерений

Измерения проводят при следующих лабораторных условиях:

- температура окружающего воздуха, °C - 25 +/- 5;

- атмосферное давление, кПа - 97 +/- 10;

- относительная влажность, % - 65 +/- 25;

- частота переменного тока, Гц - 50 +/- 5;

- напряжение в сети, В - 220 +/- 10.

Помещение, в котором проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

Все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.

6.3.2 Подготовка к проведению измерений

6.3.2.1 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,2 моль/дм³

В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 75 см³ воды, осторожно приливают 1,7 см³ концентрированной соляной кислоты, доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Раствор устойчив в течение трех месяцев при хранении в герметично закрытой емкости.

6.3.2.2 Приготовление буферных растворов

а) Приготовление буферного раствора с (1,0 +/- 0,1) ед. pH

Взвешивают (1,49 +/- 0,1) г хлористого калия, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки водой и тщательно перемешивают. Затем в стакане вместимостью 100 см³ смешивают 25 см³ полученного раствора с 67 см³ раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,2 моль/дм³. При необходимости доводят значение pH раствора до (1,0 +/- 0,1) ед. pH концентрированной соляной кислотой, регистрируя показания pH-метра.

Раствор устойчив в течение трех месяцев при хранении в герметично закрытой емкости.

б) Приготовление буферного раствора с (4,5 +/- 0,1) ед. pH

Взвешивают (1,64 +/- 0,1) г уксуснокислого натрия, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, доводят до метки водой и тщательно перемешивают. При необходимости доводят значение pH раствора до (4,5 +/- 0,1) ед. pH концентрированной соляной кислотой, регистрируя показания pH-метра.

Раствор устойчив в течение трех месяцев при хранении в герметично закрытой емкости.

6.3.2.3 Измерение проб

а) Измерение массовой концентрации суммы антоцианинов в соковой продукции, не содержащей нерастворимые в воде вещества

В две мерные колбы, вместимостью 50 см³ каждая, помещают по 2,5 см³ аликвоты пробы, подготовленной по разделу 4, и доводят до метки буферными растворами с 1,0 и 4,5 ед. pH (см. 6.3.2.2), содержимое в двух колбах перемешивают, выдерживают в течение 15 мин и проводят измерение оптической плотности каждого раствора при длинах волн 510 и 700 нм соответственно. Измерение оптической плотности растворов при 700 нм проводят для установления величины поглощения света посторонними примесями.

б) Измерение массовой концентрации суммы антоцианинов в соковой продукции, содержащей мякоть или нерастворимые в воде вещества

Пробы предварительно гомогенизируют, а затем центрифугируют в течение 20 мин или фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

После этого в две мерные колбы, вместимостью 50 см³ каждая, отбирают по 2,5 см³ аликвоты прозрачного слоя или фильтрата и доводят до метки буферными растворами с 1,0 и 4,5 ед. pH (см. 6.3.2.2), содержимое в двух колбах перемешивают, выдерживают в течение 15 мин и проводят измерение оптической плотности каждого раствора при длинах волн 510 и 700 нм соответственно. Измерение оптической плотности при 700 нм проводят для установления величины поглощения света посторонними примесями.

в) Измерение массовой доли суммы антоцианинов в концентрированных соках проводят после их предварительного разбавления водой весовым методом в соотношении 1:5.

При вычислении по 6.4.3 учитывают коэффициент разбавления F.

Затем проводят процедуры как указано в 6.3.2.3 а.

г) Измерения оптической плотности подготовленных проб проводят на спектрофотометре при длинах волн 510 и 700 нм. Результатом измерений является разность оптической плотности растворов с 1,0 и 4,5 ед. pH при длинах волн 510 и 700 нм соответственно, которая пропорциональна массовой концентрации (массовой доле) антоцианинов в растворе.

Значения оптической плотности растворов должны находиться в пределах 0,2 - 1,0.

Если значения оптической плотности растворов, приготовленных по 6.3.2.3 а, 6.3.2.3 б более 1,0, то уменьшают объем аликвоты (V₂) при разбавлении в мерной колбе (V₁). Для растворов, имеющих значения оптической плотности менее 0,2, увеличивают объем аликвоты.

6.4 Обработка и оформление результатов измерений

Измерения проб проводят два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-1 (подраздел 3.14) и ГОСТ ИСО 5725-2.

6.4.1 Разность оптической плотности вычисляют как разность оптических плотностей растворов при разных длинах волн и соответствующих значениях pH по формуле

 

(1)

 

где A₅₁₀ - оптическая плотность раствора пробы при длине волны 510 нм, е. о. п.;

A₇₀₀ - оптическая плотность раствора пробы при длине волны 700 нм, е. о. п.

6.4.2 Массовую концентрацию антоцианинов в соковой продукции (см. 6.3.2.3 а и 6.3.2.3 б) C, мг/дм³, в пересчете на цианидин-3-глюкозид, вычисляют по формуле

 

(2)

 

где - разность оптической плотности раствора, е. о. п.;

M - молекулярная масса цианидин-3-глюкозида, равная 449,2 г/моль;

V₁ - вместимость мерной колбы, взятой для разбавления, см³;

V₂ - объем аликвоты, взятой на определение, см³;

- молярный коэффициент экстинкции цианидин-3-глюкозида, ;

l - длина оптического пути кюветы, см.

6.4.3 Массовую долю антоцианинов в концентрированной соковой продукции (см. 6.3.2.3 в) X, млн^-1, в пересчете на цианидин-3-глюкозид, вычисляют по формуле

 

(3)

 

где - разность оптической плотности раствора, е. о. п.;

M - молекулярная масса цианидин-3-глюкозида, равная 449,2 г/моль;

V₁ - вместимость мерной колбы, взятой для разбавления, см³;

F - величина фактора разбавления;

- молярный коэффициент экстинкции цианидин-3-глюкозида, ;

l - длина оптического пути кюветы, см;

V₂ - объем аликвоты, взятой на определение, см³;

m - масса пробы, взятой для определения, г.

Все вычисления проводят с точностью до третьего десятичного знака.

Расхождение между двумя параллельными определениями (в процентах от среднего значения), выполненными в условиях повторяемости, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) r_отн, приведенного в таблице 2, при вероятности P = 0,95.

 

Таблица 2

 

Основные метрологические характеристики метода определения

массовой концентрации или массовой доли суммы антоцианинов

при доверительной вероятности P = 0,95

 

Наименование показателя (при P = 0,95 и n = 2)	Значение показателя при диапазонах измерений массовой концентрации (массовой доли), мг/дм3 (млн-1)
	От 5 до 100 включ. <1>	Св. 100 до 1000 включ. <2>	Св. 1000 до 5000 включ. <3>
Предел повторяемости (сходимости) rотн, %	14	9	8
Предел воспроизводимости Rотн, %	19	14	10
Границы относительной погрешности , %	14	10	7
Предел обнаружения метода, мг/дм3 (млн-1)	1,0
<1> Исследования проводились на образцах клубники, выращенной в средней полосе Российской Федерации. <2> Исследования проводились на образцах клюквы, выращенной в Российской Федерации. <3> Исследования проводились на образцах черной смородины, выращенной в средней полосе Российской Федерации.

 

За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений.

Границы относительной погрешности определения массовой концентрации (массовой доли) суммы антоцианинов , %, при соблюдении условий, регламентированных настоящим методом, не должны превышать значений, приведенных в таблице 2.

Окончательные результаты определений в документах, предусматривающих их использование, представляют согласно ГОСТ ИСО/МЭК 17025 с указанием метода определения и настоящего стандарта в виде

 

и , при P = 0,95,

 

где , - среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, мг/дм³ (млн^-1);

- границы относительной погрешности измерений, % (см. таблицу 2).

Числовое значение окончательного результата определения должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение границы абсолютной погрешности. Значение границы абсолютной погрешности приводят с двумя значащими цифрами.

В случае, если результат определения менее нижней границы диапазона измерений, то приводят следующую запись: "Массовая концентрация (массовая доля) антоцианинов, в пересчете на цианидин-3-глюкозид, менее 5 мг/дм³ (млн^-1)".

6.5 Контроль качества результатов измерений при реализации метода в лаборатории

6.5.1 Контроль повторяемости результатов измерений

Контроль повторяемости результатов измерений массовой концентрации или массовой доли антоцианинов проводят при получении каждого результата путем сравнения расхождения между результатами двух параллельных определений с пределом повторяемости (сходимости), приведенным в таблице 2.

Повторяемость результатов признают удовлетворительной при условии

 

или (4)

 

где C₁, C₂ - результаты параллельных определений массовой концентрации суммы антоцианинов в пробе, подготовленной по 6.1, мг/дм³;

X₁, X₂ - результаты параллельных определений массовой доли суммы антоцианинов в пробе, подготовленной по 6.2 и 6.3, млн^-1;

r_отн - значение предела повторяемости (см. таблицу 2), %.

При превышении предела повторяемости (сходимости) определение повторяют. При повторном превышении указанного предела выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, устраняют их и определение повторяют.

6.5.2 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

6.5.2.1 Проверку приемлемости результатов параллельных определений в условиях воспроизводимости проводят:

- при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

- проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях.

6.5.2.2 Для проведения проверки приемлемости результатов параллельных определений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует контрольные пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов параллельных определений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD_0,95 по формуле

 

или (5)

 

где , - среднеарифметические значения массовой концентрации суммы антоцианинов в пересчете на цианидин-3-глюкозид, полученные в первой и второй лабораториях, мг/дм³;

, - среднеарифметические значения массовой доли суммы антоцианинов в пересчете на цианидин-3-глюкозид, полученные в первой и второй лабораториях, млн^-1;

CD_0,95 - значение критической разности, вычисляемое по формулам

 

(6)

 

где 2,77 - коэффициент критического диапазона для двух параллельных определений, полученных в условиях воспроизводимости по ГОСТ ИСО 5725-6;

0,01 - множитель для перехода от процентов к абсолютным значениям;

- среднеарифметическое значение результатов определений, полученных в первой и второй лабораториях, мг/дм³;

- среднеарифметическое значение результатов определений, полученных в первой и второй лабораториях, млн^-1;

- показатель воспроизводимости, % (см. таблицу 2);

- показатель повторяемости, % (см. таблицу 2);

n - число параллельных определений.

6.5.2.3 Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата определений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.3.4).

6.5.3 Оперативный контроль погрешности (точности) результатов измерений

Оперативный контроль погрешности (точности) результатов измерений осуществляют методом добавок на рабочих пробах продукции.

Организацию и оценку результатов контроля осуществляют в соответствии с рекомендациями [1].

6.5.3.1 Для проведения оперативного контроля погрешности (точности) определение проводят в пробах, объем или масса которых должны соответствовать удвоенному их количеству, необходимому для проведения определения. Пробу делят на две равные части. В одну из них добавляют цианидин-3-глюкозид в таком количестве, чтобы величина добавки в 0,5 - 1,5 раза отличалась от исходного содержания компонента в пробе, но не превышала верхней границы диапазона определения массовой концентрации или массовой доли компонента с учетом границ погрешности определения (см. таблицу 2). В обеих частях пробы проводят определение в соответствии с требованиями настоящего стандарта.

6.5.3.2 Результаты контрольных определений признают удовлетворительными, если погрешность определения массовой концентрации (массовой доли) цианидина-3-глюкозида в добавке не превышает норматива оперативного контроля погрешности (точности), то есть выполняется условие

 

или (7)

 

где , - среднеарифметические значения параллельных определений массовой концентрации (массовой доли) общего диоксида серы в пробе с добавкой, мг/дм³ или млн^-1;

, - среднеарифметические значения параллельных определений массовой концентрации (массовой доли) общего диоксида серы в пробе без добавки, мг/дм³ или млн^-1;

C_доб или X_доб - величина добавки, мг/дм³ или млн^-1;

K_доб - норматив контроля погрешности, мг/дм³ или млн^-1.

При проведении внутрилабораторного контроля (P = 0,90) значение K_доб вычисляют по формулам:

 

(8)

 

или

 

(9)

 

где 0,84 - коэффициент, учитывающий вид контроля;

- границы относительной погрешности измерений массовой концентрации (массовой доли) общего диоксида серы (см. таблицу 3), %.

При проведении внешнего контроля (P = 0,95) значение K_доб вычисляют по формулам:

 

(10)

 

или

 

(11)

 

При превышении норматива оперативного контроля погрешности проводят повторные контрольные определения. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Периодичность контроля погрешности (точности) устанавливает сама лаборатория с учетом фактического состояния работ. При замене оборудования, колонок, реактивов или при построении новой градуировочной зависимости проведение оперативного контроля погрешности обязательно.

6.5.4 Контроль стабильности результатов измерений при реализации метода в лаборатории

Контроль стабильности результатов измерений в лаборатории осуществляют по ГОСТ ИСО 5725-6, используя метод контроля стабильности стандартного отклонения промежуточной прецизионности по ГОСТ ИСО 5725-6 с применением контрольных карт Шухарта.

При неудовлетворительных результатах контроля: превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения - выясняют и устраняют причины этих отклонений.

Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 (пункт 4.2).