ГОСТ 32709-2014. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Методы определения антоцианинов
5. Метод обращенно-фазовой высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
5.1 Сущность метода
Метод основан на определении индивидуальных антоцианинов путем их разделения на твердом носителе C18, привитом на высокочистую силикагелевую основу по обращенно-фазовому механизму с последующим фотометрическим детектированием при длине волны 518 нм.
Полученные хроматограммы сравнивают с профилями антоцианинов аутентичных фруктовых соков и данными, приведенными в таблице Б.2 приложения Б.
5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы
5.2.1 Хроматограф жидкостный высокоэффективный с насосом высокого давления и спектрофотометрическим детектором (рабочий диапазон длин волн поглощения от 200 до 600 нм) с относительным среднеквадратическим отклонением выходных сигналов не более 5% (по площади и времени выхода пиков), снабженный программно-аппаратным комплексом для сбора и обработки данных.
5.2.2 Колонка для ВЭЖХ длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенной фазой - октадецилсиликагелем C18, размером частиц 5 мкм <*>.
--------------------------------
<*> Колонки марок Phenomenex Luna и Hypersil C18 обеспечивают требуемую эффективность. Данная информация не является рекламой указанных колонок и приведена для удобства пользователей настоящего стандарта.
5.2.3 Микрошприцы хроматографические вместимостью 10 мм3, ценой деления 0,1 мм3 и вместимостью 20 мм3, ценой деления 0,2 мм3.
5.2.4 Весы лабораторные по ГОСТ OIML R 76-1 высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания не более 150 г со значением среднеквадратического отклонения (СКО), не превышающим 0,05 мг и пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,005 г.
5.2.5 Фильтры мембранные с диаметром пор 0,20 и 0,45 мкм для фильтрования подвижной фазы и проб.
5.2.6 pH-метр по ГОСТ 9245 с диапазоном измерений от 2 до 14 ед. pH, погрешностью измерений не более 0,05 ед. pH, снабженный комбинированным стеклянным электродом.
5.2.7 Пипетки градуированные 1-2-1, 1-2-2, 1-2-5, 1-2-10 и 1-2-25 по ГОСТ 29227.
5.2.8 Колбы мерные 2-25-2 и 2-100-2 по ГОСТ 1770.
5.2.9 Емкости для жидких проб (виалы) вместимостью 2 - 10 см3.
5.2.10 Центрифуга лабораторная с фактором разделения не менее 1000g.
5.2.11 Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336:
- воронки лабораторные,
- стаканы В-1-50, В-1-100 и Н-1-1000.
5.2.12 Вода по ГОСТ ИСО 3696, 2-й степени чистоты.
5.2.13 Ацетонитрил для градиентной ВЭЖХ, массовой долей основного вещества не менее 99%.
5.2.14 Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552, ч.д.а.
5.2.15 Пробирки полимерные центрифужные с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см3.
5.2.16 Установка лабораторная для вакуумной фильтрации жидкостей с мини-насосом.
5.2.17 Соковыжималка бытовая, блендер бытовой или гомогенизатор, любой конструкции.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам, а также реактивов, посуды и материалов, по качеству не хуже вышеуказанных.
5.3 Подготовка к проведению определений
5.3.1 Подготовка проб для измерений
Для качественного определения антоцианинов в концентрированных соках и пюре взвешивают 1 г пробы, подготовленной по разделу 4, с записью результата до третьего десятичного знака. Пробу разбавляют в 5 см3 воды (пюре и соковую продукцию с высоким содержанием растворимых сухих веществ разбавляют водой в массовом соотношении от 1:2 до 1:5). Подготовленную пробу для удаления мутной взвеси центрифугируют и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.
Для качественного определения антоцианинов в другой соковой продукции, а также в соках прямого отжима 1 г пробы, подготовленной по разделу 4, без предварительного разбавления центрифугируют и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
При суммарном содержании антоцианинов в соке менее 0,1% пробу, подготовленную по разделу 4, фильтруют через мембранный фильтр, не разбавляя.
Примечание - Подготовку проб сока из свежих и (или) сохраненных свежими фруктов проводят с применением вспомогательного оборудования (см. 5.2.17) и последующим центрифугированием.
5.3.2 Приготовление подвижной фазы
Готовят раствор ортофосфорной кислоты с кислотностью (2,0 +/- 0,1) ед. pH. Для этого в стакан с водой по каплям добавляют концентрированную ортофосфорную кислоту, регистрируя показания pH-метра.
Для приготовления подвижной фазы полученный раствор ортофосфорной кислоты смешивают с ацетонитрилом в соотношении 88:12 в процентах по объему. Подвижную фазу фильтруют под вакуумом через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Срок хранения раствора подвижной фазы в плотно укупоренной посуде в холодильнике при температуре не более 10 °C при условии визуального отсутствия нерастворимых веществ и помутнения - одна неделя.
5.3.3 Порядок проведения определений
5.3.3.1 Подготовка хроматографа к работе
Включение и подготовку прибора к работе, вывод его на режим и выключение по окончании работы осуществляют в соответствии с руководством по эксплуатации.
Перед проведением определений хроматографическую систему кондиционируют подвижной фазой до установления стабильной базовой линии в условиях и порядке, рекомендованных производителем.
5.3.3.2 Условия проведения хроматографических измерений:
- температура термостата колонки, °C - 35 +/- 1;
- детектирование - фотометрический детектор с длиной волны 518 нм;
- объем вводимой пробы, мм3 - 10 - 20;
- элюент - раствор ортофосфорной кислоты (см. 5.3.2);
- скорость подачи элюента, см3/мин - 1,0;
- режим элюирования - градиентный, в соответствии с таблицей 1.
Таблица 1
Состав подвижной фазы
Время, мин | Состав подвижной фазы (элюента), об. % | ||
Ортофосфорная кислота | Ацетонитрил | Тип градиента | |
0 | 90 | 10 | Линейный |
20 | 75 | 25 | |
30 | 60 | 40 | |
5.3.3.3 Проведение измерений
В инжектор хроматографа микрошприцем вводят по 10 - 20 мм3 пробы, подготовленной по 5.3.1, и проводят измерения в условиях, указанных в 5.3.3.2.
Регистрируют на хроматограммах соответствующие пики. Порядок элюирования основных специфических, индивидуальных антоцианинов приведен в таблице Б.1 приложения Б.
5.4 Обработка и оформление результатов определений
Идентификацию пиков основных специфических, индивидуальных антоцианинов осуществляют по абсолютным временам удерживания, путем сравнения полученных хроматограмм соковой продукции с профилями антоцианинов сока, полученного из одноименных фруктов, или с профилями антоцианинов, приведенных в приложении Б.
Примеры хроматограмм с профилями антоцианинов для некоторых ягодных соков приведены на рисунках Б.1 - Б.5 приложения Б.
Систематизированные данные, характеризующие порядок выхода основных специфических, индивидуальных антоцианинов и состав таких антоцианинов в соковой продукции из фруктов, приведены в таблице Б.2 приложения Б.
Относительное содержание индивидуальных антоцианинов, Xi, %, вычисляют как отношение площади хроматографического пика индивидуального антоцианина к сумме площадей пиков всех идентифицированных антоцианинов по формуле
(1)
где Si - площадь пика i-го антоцианина на хроматограмме, у. е·с;
n - количество пиков идентифицированных компонентов на хроматограмме.
Подписаться на обновления